周肖英，林 彬，侯云華，司淑平

1江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院無(wú)錫衛(wèi)生分院護(hù)理系，江蘇 無(wú)錫 214028；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 無(wú)錫 214000

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率位居惡性腫瘤的前列。肝癌呈快速進(jìn)展、早期轉(zhuǎn)移、化療抵抗的特點(diǎn)，很多患者確診時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，預(yù)后很差。因此，研究HCC 發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制，探尋HCC診斷治療的分子靶標(biāo)，對(duì)改善患者的預(yù)后有十分積極的意義。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）蛋白是一種細(xì)胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白，通過(guò)糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白（glycosyl-phosphatidylinositol anchor，GPI）連接到細(xì)胞膜表面［1］。錨定到細(xì)胞表面的GPC3 是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分相互作用的關(guān)鍵糖蛋白，具有強(qiáng)大的與蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等功能性生物大分子結(jié)合的潛力，尤其是結(jié)合多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等。GPC3 與多種生長(zhǎng)因子結(jié)合形成受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，激活生長(zhǎng)因子受體的酪氨酸激酶活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、黏附、增殖和遷移［2-3］。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，HCC 患者循環(huán)miR-202 與GPC3 的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，但作用機(jī)制不明，需要進(jìn)一步深入研究以闡明其相互調(diào)控關(guān)系，為HCC 的臨床早期診斷和治療提供有效的生物學(xué)靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 材料

收集南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院2016 年1 月—2018 年12 月手術(shù)的原發(fā)性HCC 患者126 例，術(shù)前未接受化療、放療及其他方式治療，其中男97 例，女29 例，男∶女=1∶0.30，年齡42～81 歲，中位年齡56 歲。所有病例的手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，其診斷、分型及分期依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）與國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的標(biāo)準(zhǔn)。從臨床檢驗(yàn)中心獲取其中64 例患者的術(shù)前血清凍存樣本，另取20 例體檢的健康人血清作為對(duì)照。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情同意。

人肝癌HepG2 細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所，在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM 培養(yǎng)液、37 ℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)，加入0.2%胰酶消化，添加含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 臨床標(biāo)本的GPC3 免疫組化及miR-202 的qRT-PCR檢測(cè)

手術(shù)標(biāo)本在癌組織、距癌組織邊緣3 cm以外的癌旁組織取材，經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。鼠抗人GPC3單抗及SP試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。GPC3單抗工作濃度1∶100，每張切片放大200倍計(jì)數(shù)5個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞在全部癌細(xì)胞中所占比例以及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度來(lái)計(jì)分。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜1/3、1/3～＜2/3、≥2/3分別計(jì)為1、2、3分；按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分，無(wú)染色為0分，淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)為1、2、3 分。兩項(xiàng)分值相加，積分0 分判斷為（-），1～2分為（+/-），3～4分為（+），5～6分為（++）。積分≥3分的患者為陽(yáng)性病例。

64例HCC患者術(shù)前血清樣本及20例健康人對(duì)照血清樣本，經(jīng)TRIzolTMLS試劑盒（Thermo Fisher公司，美國(guó)）裂解提取總RNA，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-202 的含量。所用逆轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAGG-3′；PCR 上游引物5′-GCTGGAGAGGTATAGGGCA-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAG GT-3′；所用內(nèi)參U6 基因上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。所有引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR總反應(yīng)體系包括上、下游引物各0.8 μL，SYBR@Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，模板cDNA 2 μL，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃3 s、60 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.2 肝癌細(xì)胞系miR-202過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)miR-202 mimics并由廣州銳博生物科技公司合成。培養(yǎng)HepG2細(xì)胞系，按1×104個(gè)/孔接種96孔板，24 h后細(xì)胞貼壁，換培養(yǎng)液，加入miR-202 mimics（終濃度20 nmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)72 h。設(shè)置miCtrl陰性對(duì)照組。收集細(xì)胞，經(jīng)TRIzol試劑盒裂解細(xì)胞提取總RNA，采用qRT-PCR檢測(cè)miR-202的表達(dá)水平。抽提總蛋白，Western blot檢測(cè)GPC3的表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞增殖活性的CCK8檢測(cè)

通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)miR-202 mimics對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性的影響。5 型野生型病毒（WAd5）作為對(duì)照。收集HepG2細(xì)胞，100 μL/孔傳至96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，24 h后細(xì)胞貼壁，換培養(yǎng)液，加入miR-202 mimics，終濃度20 nmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)8個(gè)復(fù)孔；棄培養(yǎng)液，加入0.1 mol/L PBS溶液100 μL/孔，按試劑盒說(shuō)明加CCK8試劑，置孵箱內(nèi)過(guò)夜；采用Model 550 Microplate Reader（BIORAD公司，美國(guó)）測(cè)定570 nm波長(zhǎng)吸光度值，校正波長(zhǎng)為655 nm，繪制細(xì)胞存活曲線。

1.2.4 miR-202靶基因的Luciferase報(bào)告基因測(cè)定

合成GPC3 基因的3′-UTR 野生序列（5′-TTATCCTGTATACCTCC -3′）與突變序列（5′ -TTATCCTGCGCGTTATC-3′），插入到Luciferase載體（pGL3-Control，Promega 公司，美國(guó)）中，構(gòu)建pGL3-GPC3 和pGL3-mGPC3 質(zhì)粒。收集培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞，常規(guī)鋪24孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后換培養(yǎng)液，加入終濃度20 nmol/L 的miR-202 mimics（設(shè)置miCtrl 為陰性對(duì)照），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后取pGL3-Control 和pGL3-GPC3（或pGL3-mGPC3）各200 ng，通過(guò)Effectene Transfection Reagent（Qiagen公司，美國(guó)）分別與pRL-TK 20 ng共轉(zhuǎn)染，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h。參考Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行細(xì)胞的裂解回收，以LB-9506 型Luminometer（Berthold Technologies 公司，美國(guó)）測(cè)定Luciferase活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者肝組織GPC3表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系

HCC 患者126 例中，GPC3 總陽(yáng)性率為77.78%（98/126），陽(yáng)性物質(zhì)分布于胞核和胞漿（圖1），而癌旁組織陽(yáng)性率僅為8.73%（11/126），癌組織GPC 表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（χ2=122.370，P＜0.001）。分析GPC3 與HCC 臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，GPC3表達(dá)水平與HCC細(xì)胞組織學(xué)分化類(lèi)型有關(guān)，低分化類(lèi)型HCC的GPC3陽(yáng)性率較高；GPC3水平與HCC肝內(nèi)微血管侵犯相關(guān)，但與性別、年齡、腫瘤大小、臨床分期無(wú)關(guān)（表1）。

2.2 肝癌患者循環(huán)miR-202水平及其與GPC3之間的關(guān)系

圖1 HCC組織及癌旁組織GPC3免疫組化（×200）Figure 1 Immunohistochemistry of GPC3 in HCC and adjacent tissues（×200）

表1 HCC患者GPC3表達(dá)與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系Table 1 Relationship between GPC3 expression and clinicopathological features of HCC

64例HCC患者術(shù)前血清樣本及20例健康人對(duì)照血清樣本，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)miR-202的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC 患者血清miR-202 含量明顯低于健康人（圖2A）。進(jìn)一步分析血清miR-202 含量與癌組織GPC3的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GPC3陽(yáng)性患者具有更低的循環(huán)miR-202水平（圖2B）。

2.3 肝癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-202能下調(diào)GPC3含量

HepG2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-202 mimics 后，qRT-PCR檢測(cè)miR-202表達(dá)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞miR-202水平升高（圖3A）。Western blot 檢測(cè)GPC3 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨miR-202水平升高，癌細(xì)胞GPC3水平下降（圖3B、C）。

圖2 HCC 患者血清中循環(huán)miR-202 的含量及其與GPC3的關(guān)系Figure 2 Serum circulating miR-202 content and its relationship with GPC3 in HCC patients

2.4 肝癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-202能抑制細(xì)胞增殖

HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-202 mimics后，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-202 mimics后，癌細(xì)胞存活率下降，24 h、48 h、72 h 的細(xì)胞存活率分別為（81.16±13.33）%、（68.73±8.67）%、（53.14±6.67）%（圖4）。

2.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)GPC3 是miR-202的靶基因

Luciferase 報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Control 和pGL3-GPC3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，測(cè)定Luciferase活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pGL3-Control 組轉(zhuǎn)染miCtrl 和miR-202 mimics后，Luciferase 活性無(wú)明顯變化；pGL3-GPC3 組轉(zhuǎn)染miCtrl 和miR-202 mimics 后，Luciferase 活性差異明顯，miR-202 mimics 明顯下調(diào)Luciferase 活性（圖5）。帶有突變序列的pGL3-mGPC3組轉(zhuǎn)染miCtrl 和miR-202 mimics后，Luciferase活性無(wú)明顯變化。

3 討論

圖3 HepG2細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-202對(duì)GPC3表達(dá)的影響Figure 3 Effects of miR-202 overexpression on GPC3 expression in HepG2 cells

圖4 過(guò)表達(dá)miR-202抑制HepG2細(xì)胞增殖Figure 4 Overexpressed miR-202 inhibited proliferation of HepG2 cells

GPC3 在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化方面起重要作用，與HCC 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。已有很多研究表明，GPC3在HCC中特異性高表達(dá)，并賦予HCC細(xì)胞高度的侵襲轉(zhuǎn)移潛能，提示GPC3 在調(diào)控HCC 細(xì)胞生長(zhǎng)分化和惡性進(jìn)展方面起重要作用［4-5］。因此，GPC3已用于肝癌的診斷和治療，是具有高靈敏性、高特異性和治療高效性的生物靶點(diǎn)。

圖5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果Figure 5 Results of luciferase reporter gene assay

在診斷方面，GPC3 對(duì)肝癌診斷具有較好的靈敏度和特異度。一項(xiàng)Meta 分析顯示，GPC3 單一指標(biāo)用于HCC 診斷的靈敏度可達(dá)59.2%（95% CI：55.0%～63.0%），高于AFP單一指標(biāo)診斷HCC的靈敏度51.9%（95%CI：47.0%～56.0%）；兩者診斷的特異度分別為84.8%（95%CI：82.0%～87.3%）和94.0%（95%CI：92.1%～95.6%），AFP診斷特異度略高。因此，GPC3和AFP診斷性O(shè)R（DOR）分別為18.0（95%CI：5.4～60.4）和23.4（95%CI：10.3～53.2），而聯(lián)合兩個(gè)標(biāo)志物（SROC）的曲線下面積（AUC）為0.81（95%CI：0.77～0.84），提示GPC3 對(duì)HCC 的診斷可與AFP媲美，且可與AFP 協(xié)同用于肝癌的早期診斷，大幅提高肝癌診斷的正確率［6-7］。在治療方面，由于GPC3 在HCC 中表達(dá)的特異性很高，在正常肝組織中幾乎不表達(dá)，因此理所當(dāng)然成為肝癌靶向治療的理想分子靶標(biāo)，而研究較多的就是GPC3 全長(zhǎng)抗體治療策略［8］。針對(duì)GPC3 研發(fā)的人鼠嵌合型抗體GC33，在體內(nèi)能介導(dǎo)抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性，明顯抑制GPC3 陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞HepG2 和Huh-7 的小鼠移植瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)GPC3陰性的肝癌細(xì)胞移植瘤則無(wú)效［9］。近來(lái)，人們又研發(fā)了靶向GPC3 的嵌合抗原受體T 細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T），為晚期HCC 患者帶來(lái)了希望［10］。目前國(guó)內(nèi)已有多個(gè)GPC3的CAR-T細(xì)胞進(jìn)入臨床試驗(yàn)［11-12］。基于上述GC33 單抗的scFv 融合了CD28、CD137 和CD3ζ的第3代CAR-T，已證明具有誘導(dǎo)IFN-γ和IL-2產(chǎn)生的功能，能抑制GPC3 陽(yáng)性的HCC 裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)［13］。

雖然人們對(duì)GPC3在肝癌中的作用和意義已經(jīng)有了充分了解，但其分子調(diào)控機(jī)制還有很多未明之處?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，GPC3 可影響多種信號(hào)途徑來(lái)促進(jìn)肝癌發(fā)展［14］。GPC3能夠與Wnt結(jié)合形成復(fù)合物，激活經(jīng)典的Wnt/β-Catenin信號(hào)分子通路，實(shí)現(xiàn)刺激肝癌生長(zhǎng)的目的［15］。GPC3 還可激活ERK 信號(hào)途徑，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、遷移［16］。本研究對(duì)臨床126例HCC標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)GPC3的總陽(yáng)性率為77.78%，其表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、臨床分期無(wú)關(guān)，但與細(xì)胞組織學(xué)分化類(lèi)型以及微血管侵犯高度相關(guān)，提示GPC3高表達(dá)是肝癌惡性生物學(xué)的表征，可能預(yù)示預(yù)后不良。本研究檢測(cè)了HCC 患者血清中循環(huán)miR-202 含量，發(fā)現(xiàn)HCC 患者普遍為miR-202低水平狀態(tài)，且高表達(dá)GPC3的患者具有更低水平的循環(huán)miR-202，提示兩者存在一定的相互調(diào)控關(guān)系。在肝癌HepG2 細(xì)胞中上調(diào)miR-202 表達(dá)，GPC3表達(dá)隨之下調(diào)，且癌細(xì)胞增殖活性受到抑制，證實(shí)GPC3 是miR-202 調(diào)控的靶基因。為進(jìn)一步驗(yàn)證GPC3 和miR-202 之間的關(guān)系，本研究進(jìn)行了Luciferase 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證實(shí)miR-202 可直接負(fù)調(diào)控GPC3的表達(dá)。本研究闡明了GPC3受miR-202的直接調(diào)控，為設(shè)計(jì)肝癌靶向治療策略提供了參考依據(jù)，靶向GPC3的治療策略如能輔助提高miR-202的功能，將可能產(chǎn)生協(xié)同抗肝癌的效果。