劉洋，夏書月，武晶晶

（1.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，沈陽 110024；2.中國醫(yī)科大學生命科學學院醫(yī)學遺傳學教研室，沈陽 110122）

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，惡性腫瘤致死病因中肺癌占27%，位于惡性腫瘤首位［1］。根據(jù)組織病理學特性將肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占80%～85%。相對于其他類型的肺癌，NSCLC增殖、遷移較快，約75%患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，患者5年生存率較低［2］。

微小RNA是長約22 nt的非編碼RNA，它能與目標靶基因特異性結(jié)合，通過調(diào)控靶基因的表達參與調(diào)控細胞分化、增殖、遷移以及凋亡等生理過程，在糖尿病、心力衰竭以及腫瘤等多種疾病的病理生理發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究［3-10］表明微小RNA-296（microRNA-296，miR-296）與結(jié)直腸癌、肝癌、膠質(zhì)母細胞瘤、口腔鱗狀細胞癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，提示miR-296在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。然而目前關(guān)于miR-296對NSCLC的調(diào)控作用尚不清楚。本研究探討miR-296在NSCLC增殖、凋亡和遷移等惡性生物學行為中的作用及其潛在的分子機制，旨在為NSCLC的治療及研究提供新的理論依據(jù)及思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞株

人肺腺癌細胞系 A549細胞（中科院上海細胞庫），DMEM/F12培養(yǎng)基［以色列Biological Industries（BI）公司］，胎牛血清（美國Hyclone公司），miR-296抑制劑、陰性對照、引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］，jetPRIME 轉(zhuǎn)染試劑（美國 Polyplus Transfection公司），TRIzol（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、universal SYBR qPCR master mix試劑盒、miRNA提取試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA universal SYBR qPCR master mix試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒（中國諾唯贊公司），細胞培養(yǎng)瓶、6孔板、24孔板、96孔板，Transwell小室（美國Corning公司），CCK8細胞增殖檢測試劑盒（美國 Abbkine公司）、細胞凋亡試劑盒（日本東仁公司），結(jié)晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司），BCA蛋白濃度檢測試劑盒（中國碧云天公司），S100A4抗體（美國 Abbkine公司），Tublin抗體（中國Proteintech公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染

含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A549細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待細胞密度達80%～90%后，0.5%胰蛋白酶消化，按照1 ∶2傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，2×105/孔接種于細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長融合至60%左右時，按照jetPRIME 轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別將miR-296表達載體、抑制劑及相應(yīng)陰性對照轉(zhuǎn)染細胞。設(shè)置空白對照（Control）組、miR-296過表達［miR-296（+）］組、miR-296過表達陰性對照 ［miR-296（-）］組、miR-296 抑制劑（inhibitor）組、miR-296抑制劑陰性對照（inhibitor NC）組。

1.3 實時熒光定量PCR

TRIzol-氯仿法提取細胞總RNA，莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，在Bio-rad CFX Connect系統(tǒng)中進行實時熒光定量PCR。引物序列：miR-296反轉(zhuǎn)錄引物，GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACACAGGA；miR-296上游引物，5’-GAGGGCCCCCCCTCAA-3’，下游引物，5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；RNU6-1上游引物，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以RNU6-1為內(nèi)對照，Bio-rad CFX Manager 3.1軟件分析并計算Ct值。

1.4 CCK8法測定細胞增殖能力

轉(zhuǎn)染A549細胞24 h后收集細胞，根據(jù)分組制成單細胞懸液并在顯微鏡下計數(shù)，按2×103/孔細胞接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（12、24、48、72、96 h），每孔加10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，利用多功能酶標儀測定450 nm波長處的吸光度（optical density，OD）值，并繪制細胞生長曲線。

1.5 平板克隆形成實驗

細胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰蛋白酶消化制成細胞懸液，以2×103/孔細胞鋪于6孔板中，反復吹打并搖勻，使細胞均勻分散，繼續(xù)培養(yǎng)至每個集落＞50個細胞，4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下計數(shù)并分析集落形成數(shù)。

1.6 凋亡實驗

細胞轉(zhuǎn)染72 h后胰酶消化收集細胞，PBS洗滌細胞2次，2 000 r/min離心5 min收集（1～5）×105個細胞，加入500 μL 結(jié)合緩沖液懸浮細胞，避光加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，轉(zhuǎn)至流式檢測管進行流式細胞儀檢測。

1.7 Transwell實驗

細胞轉(zhuǎn)染72 h后胰酶消化并用無血清 DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸，計數(shù)細胞，將細胞密度調(diào)節(jié)成3×104/mL，取 100 μL 接種到 Transwell（8 μm 孔徑）小室的上室，下室中注入650 μL含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，設(shè)置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS沖洗小室，用棉簽將上室中未遷移的細胞蘸去，用 4%多聚甲醛固定已遷移至膜底部的細胞30 min，結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗小室內(nèi)外，將小室的濾膜用刀片小心切下放在載玻片上，加蓋玻片，中性樹脂膠封片。顯微鏡下計數(shù)上、下、左、右和中5個視野的穿膜細胞數(shù)，各視野平均穿膜細胞數(shù)表示腫瘤細胞的遷移能力。

1.8 Western blotting檢測

細胞轉(zhuǎn)染72 h后RIPA常規(guī)提取細胞總蛋白，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒使用說明測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度調(diào)整各組樣品體積，沸水煮10 min使蛋白充分變性，取30 μg蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，100 V電壓50 min將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，S100A4抗體（1 ∶1 000稀釋）、Tublin抗體（1 ∶2 000稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，相應(yīng)二抗（1 ∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜后，利用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、Bio-rad凝膠成像分析儀掃描分析蛋白豐度。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有實驗均重復3次，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-296轉(zhuǎn)染A549細胞轉(zhuǎn)染效率的鑒定

結(jié)果顯示，與miR-296（-）組比較，miR-296（+）組miR-296表達顯著上調(diào)（P＜ 0.01）；與inhibitor NC組比較，inhibitor組miR-296表達顯著下調(diào)（P＜ 0.01），見表1，表明轉(zhuǎn)染成功。

2.2 miR-296對A549細胞增殖能力的影響

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，與Control組和miR-296（-）組比較，miR-296（+）組A549細胞OD值顯著降低；與Control組和inhibitor NC組比較，inhibitor組A549細胞OD值則顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），說明miR-296對A549細胞的增殖能力起到抑制作用。見圖1。

表1 各組A549細胞中miR-296表達、細胞克隆數(shù)量、凋亡、遷移能力比較Tab.1 Comparison of miR-296 expression，number of colonies，apoptosis，and migration in A549 cells

圖1 miR-296對A549細胞增殖能力的影響Fig.1 Effect of miR-296 on the proliferation of A549 cells

2.3 miR-296對A549細胞克隆形成的影響

利用平板克隆技術(shù)分析miR-296對A549細胞克隆形成能力的影響，結(jié)果顯示，與miR-296（-）組比較，miR-296（+）組A549細胞形成克隆體積更小、數(shù)量更少（P＜ 0.05），與inhibitor NC組和miR-296（+）組比較，inhibitor組A549細胞形成克隆體積更大、數(shù)量更多（P＜ 0.05，P＜ 0.01），說明miR-296能抑制A549細胞的克隆形成能力。見表1、圖2。

2.4 miR-296對A549細胞凋亡的影響

流式Annexin-FITC/PI雙染法分析miR-296對A549細胞凋亡率的影響，結(jié)果顯示，與miR-296（-）組比較，miR-296（+）組A549細胞的凋亡率顯著增加（P＜ 0.05）；與inhibitor NC組比較，inhibitor 組A549細胞的凋亡率顯著減少（P＜ 0.05），說明miR-296促進A549細胞凋亡。見表1、圖3。

2.5 miR-296對A549細胞遷移能力的影響

圖2 miR-296對A549細胞克隆形成的影響Fig.2 Effect of miR-296 on clone formation potential of A549 cells.

圖3 miR-296對A549細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-296 on A549 cell apoptosis

Transwell細胞遷移實驗分析miR-296對A549細胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，與miR-296（-）組比較，miR-296（+）組A549細胞遷移能力顯著降低（P＜ 0.01）；與inhibitor NC組和miR-296（+）組比較，inhibitor組A549細胞遷移能力顯著升高（均P＜0.01），說明miR-296對A549細胞的遷移能力起到抑制作用。見表1、圖4。

圖4 miR-296對A549細胞遷移能力的影響 ×200Fig.4 Effect of miR-296 on the migration ability of A549 cells ×200

2.6 miR-296對A549細胞S100A4蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，與miR-296（-）組比較，miR-296（+）組A549細胞S100A4蛋白表達顯著下調(diào)（P＜ 0.05），與inhibitor NC組和miR-296（+）組比較，inhibitor組A549細胞S100A4蛋白表達顯著上調(diào)（P＜ 0.05，P＜0.01），說明miR-296抑制A549細胞S100A4蛋白表達。見圖5。

3 討論

NSCLC包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌。與小細胞肺癌比較，NSCLC增殖、遷移相對較快，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期。因此，明確影響NSCLC增殖、遷移的因素是目前臨床急需解決的難題。

近些年隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)越來越多的微小RNA能夠參與調(diào)控腫瘤細胞分化、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）等生物學特性，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11］。miR-296定位于20q13.32，具有高度的保守性，在許多生命活動中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

圖5 miR-296對A549細胞中S100A4蛋白表達的影響Fig.5 Eeffect of miR-296 on S100A4 levels in A549 cells.

大量證據(jù)表明miR-296參與腫瘤的調(diào)控作用，而且不同腫瘤中的調(diào)控作用亦不同。VAIRA 等［12］研究發(fā)現(xiàn)miR-296在許多腫瘤組織中表達缺失，且與結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、甲狀腺癌、肝癌等腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。VAIRA 等［12］利用人乳腺癌細胞MDA-MB231證明了miR-296發(fā)揮著重要的腫瘤抑制作用。有研究［9］報道抑制miR-296能夠通過誘導EMT促進卵巢癌細胞侵襲，而恢復miR-296表達后腫瘤增殖生長被抑制［12-13］，以上結(jié)果均表明miR-296發(fā)揮抑制腫瘤的作用。然而也有研究顯示miR-296起到促進腫瘤生長的作用，LEE等［6］發(fā)現(xiàn)miR-296-5p 通過SOCS2/STAT3下調(diào)NF2受體和Caspase-8促進膠質(zhì)母細胞瘤侵襲。本研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-296表達載體后，A549細胞增殖、克隆形成及細胞遷移能力顯著降低，細胞凋亡率明顯上升（均P＜ 0.05）；抑制miR-296后，A549細胞增殖、克隆形成及遷移能力顯著升高，凋亡率降低（均P＜ 0.05），提示miR-296在A549細胞中發(fā)揮腫瘤抑制作用。

S100A4是S100 蛋白家族中的一員，是一種小Ca2+結(jié)合蛋白，正常組織中不表達或低表達，而在許多腫瘤（胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等［14-17］）中高表達，并且在惡性轉(zhuǎn)化、血管生成、遷移和侵襲中發(fā)揮調(diào)控作用。有研究［18］表明miR-296通過靶向調(diào)控S100A4抑制結(jié)直腸癌EMT。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-296過表達時S100A4蛋白表達下調(diào)，而抑制miR-296表達S100A4蛋白表達上調(diào)，提示miR-296可能通過靶向調(diào)控S100A4表達影響A549細胞的惡性生物學行為。

綜上所述，miR-296抑制人肺腺癌A549細胞的增殖、遷移，促進凋亡，其作用機制可能是通過靶向調(diào)控S100A4表達來實現(xiàn)的，本研究為NSCLC的臨床治療提供新的靶點和理論基礎(chǔ)。目前，miR-296/S100A4調(diào)控人肺腺癌A549細胞惡性生物學行為的具體機制尚不清楚，仍需進一步研究論證。