傅煜，張赫楠，姜若騰，符爽，張繼紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液研究室，沈陽(yáng) 110022）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一組異質(zhì)性很強(qiáng)的造血干細(xì)胞克隆性疾病，并具有高風(fēng)險(xiǎn)向白血病轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)，臨床診斷和治療均極為復(fù)雜。另外，由于早期MDS細(xì)胞形態(tài)改變不明顯，臨床表現(xiàn)隱匿，給這一部分患者的確診及治療帶來(lái)難度。早期MDS診斷主要通過(guò)骨髓形態(tài)及染色體核型檢測(cè)，隨著二代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，基因突變譜系在MDS中的分布開(kāi)始為臨床診療提供依據(jù)。世界衛(wèi)生組織2016版MDS修訂分型亦將SF3B1基因突變納入MDS伴環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞增多（MDSring sideroblasts，MDS-RS）的診斷依據(jù)［1］。隨著研究的不斷深入，會(huì)有更多的分子標(biāo)記出現(xiàn)。本研究通過(guò)探索確診MDS各類(lèi)型以及確診與疑似MDS間基因突變差異，為MDS的診斷及分型提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年8月至2019年12月就診于我院的201例確診MDS患者及87例疑似MDS患者骨髓標(biāo)本。所有入組確診及疑似MDS患者均符合2019年版中國(guó)MDS診斷和治療指南［2］的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。MDS確診患者的分型參照2016年WHO分型標(biāo)準(zhǔn)，包括MDS伴原始細(xì)胞增多（MDS-excess blasts，MDS-EB）、MDS伴單系病態(tài)（MDS-single lineage dysplasia，MDS-SLD）、MDS伴多系病態(tài)（MDS-multilineage dysplasia，MDSMLD）、MDS-RS以及MDS未分型（MDS-unclassifiable，MDS-U）?；颊咭话闩R床資料見(jiàn)表1。

1.2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞處理及樣本檢測(cè)

表1 患者一般臨床資料Tab.1 Characteristics of patients

將抗凝骨髓離心取單個(gè)核細(xì)胞于細(xì)胞裂解液（天根生化科技北京有限公司）中，混勻后靜置裂解10 min，并離心留取單個(gè)核細(xì)胞沉淀。應(yīng)用過(guò)柱法（天根生化科技北京有限公司）提取DNA以備下一步測(cè)序。

1.3 二代測(cè)序檢測(cè)基因突變

應(yīng)用MDS基因突變二代測(cè)序檢測(cè)試劑（上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司），測(cè)序深度3 000源。所檢測(cè)基因中包括2019年專(zhuān)家指南中的必檢基因（SF3B1），推薦的選做基因（RUNX1，ASXL1，DNMT3A，IDH1，IDH2，NRAS，SETBP1，SRSF2，TET2，TP53，U2AF1，EZH2，ZRSR2）以及MDS中常見(jiàn)的其他突變基因（JAK2，ETV6）共17個(gè)。按功能分類(lèi)，這17個(gè)基因涉及RNA剪切、DNA甲基化、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤抑制因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等6大功能，在MDS發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)歸中起重要作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。描述性數(shù)據(jù)分析應(yīng)用中位數(shù)、最大值、最小值相結(jié)合的方法。多獨(dú)立樣本兩兩比較及總體比較應(yīng)用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)及Kruskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中，由于納入的MDS-U患者僅2例，容易在統(tǒng)計(jì)計(jì)算中造成系統(tǒng)誤差，因此所有涉及確診患者各類(lèi)型間統(tǒng)計(jì)的計(jì)算均未涉及MDS-U這一類(lèi)型。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料分析

納入研究的201例確診及87例疑似MDS患者在年齡（P=0.289）及性別（P=1.000）方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)在確診的3類(lèi)MDS患者間，年齡（P=0.905）及性別（P=0.616）的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步將確診患者按年齡分為3組：青少年組（＜30歲，13例），中年組（30～＜60歲，83例）和老年組（≥60歲，103例）。結(jié)果顯示，好發(fā)于老年組的基因突變?yōu)镾F3B1、ASXL1；好發(fā)于青少年組的基因突變?yōu)镋TV6、SETBP1；而TP53基因突變僅發(fā)生于中年組及老年組，老年組的突變比例更高。同時(shí)，在疑似MDS患者中比較3個(gè)年齡組間基因突變差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 確診MDS患者突變基因頻次分析

表2 201例確診患者基因突變的年齡差異分析 ［n（%）］Tab.2 Age-related mutation analysis of 201 MDS patients ［n（%）］

在201例確診患者中，發(fā)生基因突變的患者149例（74.1%）。在確診的各類(lèi)型患者之間，突變陽(yáng)性率的差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041）。確診患者中突變頻率最高的5種基因分別為ASXL1、TP53、U2AF1、SF3B1和TET2。MDS-EB患者突變頻率最高的5種基因分別為ASXL1、TP53、U2AF1、RUNX1和DNMT3A，MDS-SLD/MLD患者為ASXL1、U2AF1、TP53、SF3B1、TET2，MDS-RS患者為SF3B1、TET2、ASXL1、TP53、DNMT3A。在突變個(gè)數(shù)方面，確診患者各類(lèi)型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.189），見(jiàn)表3。

具體分析17個(gè)基因的分布，發(fā)現(xiàn)SF3B1（P＜0.001）、TET2（P=0.002）在組間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于以上2個(gè)基因運(yùn)用的是多樣本差異檢驗(yàn)，進(jìn)一步進(jìn)行了3種MDS類(lèi)型間針對(duì)SF3B1和TET2基因的兩兩比較，顯示TET2的組間差異主要表現(xiàn)在MDS-EB與MDS-RS之間（P＜ 0.001），而SF3B1的組間差異則分別表現(xiàn)于MDS-EB與MDS-RS（P＜ 0.001）、MDS-SLD/MLD與MDS-RS（P＜ 0.001）之間，提示與MDS-EB相比TET2突變更好發(fā)于MDS-RS患者，而SF3B1在MDS-RS中的突變頻率亦顯著高于另外兩型。在按功能分類(lèi)的基因突變比較中，確診患者各類(lèi)型間RNA剪接功能差異明顯（P＜ 0.001）。

表3 288例確診及疑似病例突變特征Tab.3 Mutation characteristics of 288 diagnosed and suspected MDS patients

2.3 確診及疑似MDS患者間基因突變差異分析

在確診及疑似MDS患者間，發(fā)生基因突變陽(yáng)性的確診患者149例（74.1%），疑似MDS患者31例（35.6%），突變陽(yáng)性率的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），確診MDS患者基因突變陽(yáng)性率高于疑似患者。疑似病例突變頻率最高的5種基因分別為ASXL1、U2AF1、SF3B1、TET2、DNMT3A。在突變個(gè)數(shù)方面，確診患者與疑似患者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），提示確診MDS患者發(fā)生基因突變的個(gè)數(shù)更多，見(jiàn)表3。

進(jìn)一步比較確診MDS與疑似MDS間的基因分布差異，發(fā)現(xiàn)ASXL1（P=0.024）、NRAS（P=0.035）和TP53（P=0.001）3個(gè)基因在組間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中NRAS突變僅發(fā)生于確診MDS，ASXL1與TP53基因在確診患者中的突變頻率也顯著高于疑似病例，提示該3個(gè)基因與MDS相關(guān)。

2.4 確診MDS染色體分層與基因突變分析

本研究共收錄的確診MDS患者，除去未進(jìn)行染色體檢測(cè)及染色體無(wú)分裂像患者35例，參照IPSS-R預(yù)后分層原則，將166例確診MDS患者預(yù)后分為極好（1例）、好（119例）、中等（22例）、差（7例）和極差（17例）5級(jí)。分析各風(fēng)險(xiǎn)水平MDS患者的基因突變情況，由于極好組缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)資料，因此下列比較僅討論其他4組。在突變個(gè)數(shù)方面，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間IDH2（P=0.009）、TP53（P＜0.001）突變頻率的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IDH2基因突變?cè)陬A(yù)后差組的發(fā)生頻率顯著高于其他組，而TP53基因在預(yù)后極差組的發(fā)生頻率顯著高于其他組，見(jiàn)表4。

3 討論

隨著二代測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，多種對(duì)MDS具有診斷、預(yù)后判斷、指導(dǎo)治療意義的基因不斷涌現(xiàn)。MDS多發(fā)于老年，其造血細(xì)胞克隆性異常與MDS的發(fā)病相關(guān)［3］。本研究發(fā)現(xiàn)SF3B1、ASXL1突變好發(fā)于老年，ETV6、SETBP1突變好發(fā)于青年，而TP53突變僅出現(xiàn)于中老年。研究［4-5］指出血液系統(tǒng)惡性腫瘤中DNMT3A、ASXL1、TET2基因突變的發(fā)生率隨年齡增長(zhǎng)而顯著上升，與本研究結(jié)果相符。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道ETV6突變的年齡趨勢(shì)，但ETV6可通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行剪接調(diào)控參與MDS的發(fā)生，而剪接調(diào)控是導(dǎo)致衰老的重要因素，提示ETV6基因是年齡相關(guān)致病因子［6］。SETBP1基因突變可見(jiàn)于多種血液?。?］，MAKISHIMA等［8］在對(duì)急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）患者的分析中發(fā)現(xiàn)該突變多發(fā)于老年，與本研究結(jié)果不一致，可能是由于AML惡性程度更高，年齡的累積負(fù)荷更大。也不除外人種及樣本量造成的差異。TP53是重要的抑癌基因，本研究發(fā)現(xiàn)TP53突變?cè)贛DS中存在年齡差異。多項(xiàng)研究［9-11］證實(shí)該基因突變?cè)谘合到y(tǒng)惡性腫瘤中呈現(xiàn)高齡突變趨勢(shì)，與本研究結(jié)果相符。

本研究發(fā)現(xiàn)確診MDS類(lèi)別間存在突變差異。SF3B1、TET2在MDS-RS組突變率更高。有文獻(xiàn)［12-13］報(bào)道TET2突變與正常核型相關(guān)，MDS-RS患者多為正常核型，而MDS-EB患者多伴核型異常，提示與TET2的正常核型關(guān)聯(lián)性存在某種內(nèi)在聯(lián)系。目前針對(duì)MDS的基因突變極少涉及類(lèi)別間差異研究，本研究雖然樣本量較小，但也可為類(lèi)別研究提供探索性思路。

本研究結(jié)果顯示，MDS患者不同核型組的突變基因存在差異。IDH2突變好發(fā)于預(yù)后差組，而TP53基因在預(yù)后極差組的突變率更高。有研究［14］發(fā)現(xiàn)7.2%MDS患者伴T(mén)P53突變，且與復(fù)雜核型、預(yù)后高危及中位總生存期短相關(guān)，與本研究一致。對(duì)于IDH2基因的在MDS中的研究一直存在爭(zhēng)議，部分研究者認(rèn)為IDH2突變的MDS患者具有更短的總生存期和無(wú)病生存期，預(yù)后不良。也有研究［15-16］證明IDH2與MDS的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及預(yù)后關(guān)系不明。本研究結(jié)果顯示，IDH2突變更易發(fā)生于核型差的預(yù)后分組，這為IDH2的預(yù)后不良假說(shuō)提供了支持。

表4 166例確診MDS患者各染色體核型分層間基因突變特征Tab.4 Mutation characteristics of 166 diagnosed MDS patients with different karyotypes

通過(guò)疑似與確診MDS患者的突變比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ASXL1、NRAS、TP53基因在確診患者中的突變率明顯高于疑似患者，其中NRAS突變僅發(fā)生于確診患者。LINDSLEY等［17］發(fā)現(xiàn)ASXL1、TP53、DNMT3A、TET2和RUNX1是MDS最為常見(jiàn)的5種基因突變，與本研究部分相符。而NRAS基因突變雖常見(jiàn)于粒單核細(xì)胞白血病，但在診斷MDS時(shí)，當(dāng)存在一定的形態(tài)學(xué)證據(jù)，卻不完全符合MDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，NRAS突變可提供支持性證據(jù)［18］。上述發(fā)現(xiàn)提示這種確診患者的傾向性突變可能應(yīng)用于MDS的輔助診斷，為疑似患者的確診提供幫助。

綜上，本研究結(jié)果顯示，MDS患者的基因突變存在年齡、分型及危險(xiǎn)分層差異，而確診MDS與疑似患者之間也存在明顯突變差異，這將為MDS的診斷、分型及預(yù)后判斷提供幫助。