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胃食管反流對(duì)慢性間歇低氧大鼠呼吸系統(tǒng)的影響

2021-03-31 09:36李佳桐劉丹孔靈菲王瑋
關(guān)鍵詞:反流鹽酸氣管

李佳桐,劉丹,孔靈菲,王瑋

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,沈陽(yáng) 110001)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)主要引起睡眠片段化和慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)的病理生理學(xué)改變,CIH被認(rèn)為是OSAHS作為源頭性疾病影響全身的重要病理生理機(jī)制。胃食管反流性疾病(gastroesophageal reflux disease,GERD)主要發(fā)病機(jī)制為食管下括約肌壓力降低和一過性食管下括約肌松弛。SHEPHERD等[1]發(fā)現(xiàn),OSAHS患者較普通人群夜間出現(xiàn)胃食管反流癥狀的次數(shù)更多,而且經(jīng)持續(xù)氣道正壓治療后癥狀顯著減輕。反之,也有研究表明GERD與更嚴(yán)重的OSAHS相關(guān)。YOU等[2]發(fā)現(xiàn),GERD患者患OSAHS的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于正常人;DEMETER等[3]的研究也表明,經(jīng)內(nèi)鏡確診的GERD患者呼吸暫停低通氣指數(shù)更高;KIM等[4]進(jìn)一步證實(shí),GERD患者具有更高的呼吸暫停低通氣指數(shù)、更長(zhǎng)的睡眠呼吸暫停時(shí)間以及更低的血氧飽和度。動(dòng)物研究[5]也證實(shí),GERD大鼠模型會(huì)出現(xiàn)睡眠片段化和更頻繁的睡眠時(shí)相轉(zhuǎn)換。但也有研究[6]認(rèn)為,OSAHS和GERD只是通過共同危險(xiǎn)因素肥胖相關(guān)聯(lián)。OSAHS和GERD之間可能存在關(guān)聯(lián),但仍缺少確切證據(jù)。本研究擬通過反復(fù)食管鹽酸灌注構(gòu)建大鼠GERD模型,探究常氧和CIH條件下GERD對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠40只,6~7周齡,體質(zhì)量200~250 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,于20~25 ℃的環(huán)境中飼養(yǎng),給予12 h晝夜循環(huán),自由進(jìn)食生長(zhǎng)維持性飼料和水。采用隨機(jī)數(shù)字表法分成常氧組(Norm組)和CIH組,每組20只。各組內(nèi)均分別給予生理鹽水(normal saltine,NS)和鹽酸(HCI)灌注,即常氧生理鹽水灌注組(Norm+NS組)、常氧鹽酸灌注組(Norm+HCl組)、CIH生理鹽水灌注組(CIH+NS組)、CIH鹽酸灌注組(CIH+HCl組),每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CIH大鼠模型制備:將CIH組大鼠置于低氧艙內(nèi)(OxyCycler Model A84 versionl.2,美國(guó)BioSherix公司),根據(jù)文獻(xiàn)[7]的方法,向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)夂脱鯕猓恳谎h(huán)過程為180 s,即45 s充入氮?dú)?,使艙?nèi)最低氧氣濃度達(dá)到5%,維持60 s,隨后45 s 充入氧氣,使艙內(nèi)氧氣濃度達(dá)到21%,維持30 s。每天持續(xù)8 h,持續(xù)7周。Norm組大鼠與CIH組喂養(yǎng)條件一致,但僅置于空氣環(huán)境中。

1.2.2 酸反流大鼠模型制備:Norm+HCl組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后取仰臥位,將5F胃管緩慢下入大鼠食管中下段并固定,通過微量輸液泵(Perfusor Compact 5,德國(guó)Braun公司)進(jìn)行鹽酸(pH1,含0.05%胃蛋白酶)灌注,灌注速度24 mL/h,每次20 min,1次/d,持續(xù)21 d。Norm+NS組大鼠采用同樣方法灌注NS。CIH+HCl組大鼠于CIH 4周后在每日低氧結(jié)束后30 min采用同樣方法灌注鹽酸,CIH+NS組大鼠采用同樣方法灌注NS。

1.2.3 氣道反應(yīng)性評(píng)價(jià):分別于灌注前1天以及灌注第7、14和21天將大鼠置于小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)肺功能儀(Iox2,法國(guó)Emka公司)體描箱內(nèi),檢測(cè)其增強(qiáng)呼氣間歇(enhanced pause,Penh)值。參考KO等[8]的方法,給予大鼠200 μL NS以及梯度濃度的乙酰甲膽堿(methylcholine,MCh),采集Penh值。計(jì)算每只大鼠在不同濃度MCh下Penh值(PenhMCh)與霧化NS后Penh基礎(chǔ)值(PenhNS)的比值PenhMCh/PenhNS,以Penh初始值和PenhMCh/PenhNS評(píng)價(jià)氣道反應(yīng)性。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗:末次灌注24 h后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,剪開其胸腔并立即暴露氣管,向氣管內(nèi)緩慢注入5 mL PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,計(jì)數(shù)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)細(xì)胞,并同步獲取血標(biāo)本。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清和BALF中趨化因子配體1[chemokine(C-X-C motif)ligand 1,CXCL1]和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)水平。

1.2.5 HE染色:末次灌注24 h后按前述方法麻醉大鼠,全身灌流后固定大鼠氣管和肺組織,脫水透明后用HE染液(中國(guó)Biosharp公司)染色。于光鏡(Eclipse ci,日本NIKON公司)下對(duì)比觀察各組織炎癥改變情況(成像系統(tǒng):Digital sight DS-FI2,日本NIKON公司)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以表示,檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性,方差齊時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),方差不齊時(shí)采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)結(jié)果

與Norm+NS組相比,Norm+HCl組大鼠氣道組織上皮不連續(xù),終末細(xì)支氣管壁增厚、斷裂,肺泡壁輕度增厚,其內(nèi)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與CIH+NS組相比,CIH+HCl組大鼠氣道黏膜層部分脫落、固有層裸露,除肺泡內(nèi)散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)外,還出現(xiàn)典型嗜終末細(xì)支氣管周圍炎癥細(xì)胞聚集現(xiàn)象。見圖1。

2.2 各組氣道反應(yīng)性的評(píng)價(jià)

與Norm+NS組相比,Norm+HCl組Penh值升高(t=-2.319,P=0.049)。與CIH+NS組相比,CIH+HCl組Penh值也升高(t=-2.768,P= 0.024)。見圖2。

圖1 NS與鹽酸灌注21 d后大鼠氣管和肺的組織病理學(xué)改變 HE ×200Fig.1 Histopathological changes in the tracheas and lungs of the rats in each group on day 21 of perfusion with normal saline or hydrochloric acid HE ×200

圖2 灌注第21天各組大鼠Penh值的比較Fig.2 Penh values of the rats on day 21 of perfusion

MCh激發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明,鹽酸灌注14 d后,與CIH+NS組相比,CIH+HCl組PenhMCh/PenhNS增大(t=-3.657,P=0.006)。鹽酸灌注21 d后,與Norm+NS組相比,Norm+HCl組PenhMCh/PenhNS才開始增大(t=-2.422,P=0.042)。見圖3。

鹽酸灌注21 d后,Norm組和CIH組大鼠在給予16、32、64 mg/mL MCh后PenhMCh/PenhNS均增大。分別在3種濃度MCh下比較Norm組與CIH組的Δ(PenhMCh/PenhNS),以該值代表氣道對(duì)MCh的反應(yīng)性,該值越大則氣道對(duì)MCh反應(yīng)性越高。MCh濃度為32 mg/mL時(shí),與Norm組相比,CIH組Δ(PenhMCh/PenhNS)增大(t=-6.61,P< 0.001)。當(dāng)MCh濃度為64 mg/mL時(shí),與Norm組相比,CIH組Δ(PenhMCh/PenhNS)也增大(t=-3.13,P=0.014)。鹽酸灌注后CIH組大鼠氣道對(duì)MCh反應(yīng)性更高。見表1。

2.3 各組間BALF細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)的比較

圖3 給予梯度濃度MCh后各組大鼠氣道反應(yīng)性的比較Fig.3 Airway responsiveness of the rats in each group after exposure to a gradient concentration of methylcholine

表1 灌注第21天Norm組與CIH組Δ(PenhMCh/PenhNS)的比較Tab.1 Δ(PenhMCh/PenhNS)values of Norm and CIH groups on day 21 of perfusion

與Norm+NS組相比,Norm+HCl組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)(t=-3.886,P=0.005)、中性粒細(xì)胞(t=-2.631,P=0.03)和淋巴細(xì)胞(t=-6.097,P< 0.001)增多。與CIH+NS組比,CIH+HCl組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)(t=-3.466,P=0.008)、中性粒細(xì)胞(t=-3.214,P=0.012)和淋巴細(xì)胞(t=-9.940,P< 0.001)增多。

與中性粒細(xì)胞ΔNorm相比,其ΔCIH升高(t=-2.440,P=0.041)。與淋巴細(xì)胞ΔNorm相比,其ΔCIH升高(t=-2.448,P=0.040)。即與Norm組相比,鹽酸灌注后CIH組大鼠BALF中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)一步增多。見圖4。

圖4 各組BALF細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)的比較Fig.4 The numbers of inflammatory cell types and cells in total in BALF in each group

2.4 各組CXCL1和CRP水平的比較

與Norm+NS組相比,Norm+HCl組大鼠BALF中CXCL1水平升高(t=-3.680,P=0.010)。與CIH+NS組相比,CIH+HCl組大鼠BALF中CXCL1(Z=-2.309,P=0.029)和CRP(t=-3.129,P=0.014)水平升高,血清CRP水平升高(t=-4.100,P=0.003)。

與BALF中CXCL1的ΔNorm相比,其ΔCIH升高(Z=-2.309,P=0.029)。與BALF中CRP的ΔNorm相比,其ΔCIH升高(t=-3.129,P=0.014)。與血清CRP的ΔNorm相比,其ΔCIH升高(t=-1.056,P=0.322)。即與Norm組相比,鹽酸灌注后大鼠BALF中CXCL1和CRP水平進(jìn)一步升高,血清CRP水平進(jìn)一步升高。見圖5。

3 討論

GERD通過反流、反射和微吸入影響呼吸系統(tǒng)。動(dòng)物研究證實(shí),反復(fù)食管鹽酸灌注會(huì)導(dǎo)致氣道重塑、多種炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣管平滑肌過度反應(yīng)[9]及膽堿能神經(jīng)元激活[10],進(jìn)而導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高。OSAHS的主要病理生理機(jī)制為睡眠片段化和CIH,目前研究多從睡眠障礙角度探究GERD對(duì)OSAHS的影響,尚未見GERD對(duì)CIH相關(guān)損傷的研究。本研究發(fā)現(xiàn),反復(fù)食管鹽酸灌注可導(dǎo)致大鼠呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)損傷、氣道反應(yīng)性升高和炎癥水平升高。并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),與常氧條件下相比,鹽酸灌注后CIH大鼠對(duì)MCh的反應(yīng)性更高、呼吸系統(tǒng)局部和全身炎癥水平更高。本研究首次探究了鹽酸灌注對(duì)CIH大鼠呼吸系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)損傷,在鹽酸灌注14 d后開始出現(xiàn)對(duì)CIH大鼠氣道反應(yīng)性的影響,而21 d后才出現(xiàn)對(duì)常氧大鼠氣道反應(yīng)性的影響。

圖5 各組間CXCL1和CRP水平的比較Fig.5 CXCL1 and CRP levels in each group

APPEL等[11]對(duì)大鼠進(jìn)行4~16周左肺每日1次150 μL的鹽酸灌注,結(jié)果表明,鹽酸反復(fù)微吸入會(huì)導(dǎo)致肺部淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),出現(xiàn)慢性肺損傷。CHENG等[9]證實(shí)對(duì)豚鼠進(jìn)行持續(xù)14 d、每次20 min的食管鹽酸灌注,使其氣管平滑肌過度反應(yīng),并使肺阻力增大。CUI[10]對(duì)小鼠進(jìn)行持續(xù)21 d、每天2次的食管鹽酸灌注,使其氣道結(jié)構(gòu)重塑,導(dǎo)致離體氣管環(huán)在MCh刺激后產(chǎn)生更強(qiáng)的等長(zhǎng)收縮,提示其氣道反應(yīng)性升高。本研究對(duì)大鼠進(jìn)行持續(xù)21 d、每天20 min的食管鹽酸灌注后,其氣管黏膜受損,且氣道反應(yīng)性增高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),鹽酸灌注后常氧大鼠BALF中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多,且CXCL1水平升高,考慮炎癥反應(yīng)是出現(xiàn)上述現(xiàn)象的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。GERD微吸入相關(guān)的呼吸系統(tǒng)炎癥中胃蛋白酶能驅(qū)動(dòng)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并導(dǎo)致氣管黏膜屏障破壞[12],且白細(xì)胞介素-8在該趨化浸潤(rùn)過程中具有特異作用[13]。大鼠研究中普遍用CXCL1替代白細(xì)胞介素-8反映中性粒細(xì)胞趨化程度[14]。本研究結(jié)果提示,CXCL1這種特異性趨化作用僅局部作用于呼吸系統(tǒng),且常氧條件下并未產(chǎn)生全身水平的炎癥反應(yīng)。

同時(shí),本研究首次探究了反復(fù)鹽酸灌注對(duì)CIH大鼠氣道反應(yīng)性的影響,鹽酸灌注第21天Penh值升高。常氧與CIH條件下的升高程度未見差異。但MCh激發(fā)試驗(yàn)表明,CIH大鼠能被激發(fā)出更高的反應(yīng)性且出現(xiàn)的時(shí)間更早,該現(xiàn)象的具體機(jī)制仍不清楚。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),鹽酸灌注后CIH大鼠BALF中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)一步增多,并產(chǎn)生了全身水平的炎癥反應(yīng),但CXCL1趨化作用仍局限于呼吸系統(tǒng)。這提示對(duì)于氣道反應(yīng)性高的患者,特別是氣道反應(yīng)性高的OSAHS患者,要注意是否合并胃食管反流。值得注意的是,應(yīng)用抑酸劑的GERD患者胃液中胃蛋白酶濃度更高,而CXCL1主要受胃蛋白酶驅(qū)動(dòng),單獨(dú)應(yīng)用抑酸劑可能會(huì)增加胃酸中胃蛋白酶濃度,從而加重呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[12]。

本研究存在一定局限性。Norm組與CIH組大鼠來(lái)自同一群體,但由于Norm組是在常氧時(shí)直接灌注鹽酸而CIH組在低氧暴露4周后才開始灌注鹽酸,造成Norm組與CIH組大鼠造模結(jié)束時(shí)鼠齡不同。為了體現(xiàn)Norm組與CIH組的差異,本研究對(duì)Norm組與CIH組的組內(nèi)差值進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Norm組相比,CIH組大鼠鹽酸灌注后氣道反應(yīng)性和炎癥水平進(jìn)一步升高。

綜上所述,反復(fù)鹽酸灌注使大鼠出現(xiàn)氣道和肺的結(jié)構(gòu)損傷,導(dǎo)致氣道反應(yīng)性升高,這可能與炎癥水平增高有關(guān)。在CIH條件下,這種氣道反應(yīng)性更高且出現(xiàn)更早,炎癥水平更高,損傷更重。這提示,當(dāng)OSAHS患者出現(xiàn)胃食管反流時(shí),其氣道和肺損傷會(huì)更明顯。對(duì)于OSAHS合并GERD的患者,應(yīng)積極治療OSAHS疾病本身,改善CIH,同時(shí)控制胃食管反流。

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