張曉琳，邵秀麗，朱榮利，張瑞佳，郝麗英，封瑞

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽 110122）

長QT綜合征（long QT syndrome，LQTs）是一種心律失常綜合征，心電圖檢查具有QT間期延長、T波或U波異常等表征，臨床易產(chǎn)生惡性心律失常［1-2］。LQTs不僅患病率較高，猝死率也很高［3］。目前，研究［4-5］已經(jīng)明確LQTs與某些離子通道有關(guān)，例如L型鈣通道，鈉通道和鉀通道。此外，許多調(diào)節(jié)通道的蛋白也被證實與LQTs的發(fā)生相關(guān)，如鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）［6-8］。

心肌細胞上主要表達的鈉通道為NaV1.5通道，由1個α亞基和1個或多個β亞基組成。心肌NaV1.5受細胞內(nèi)CaM等多種細胞因子的調(diào)節(jié)［9-12］。CaM某些位點發(fā)生突變，導(dǎo)致NaV1.5的調(diào)節(jié)異常，最終可引發(fā)心臟疾?。?3］。本課題組早期的研究已經(jīng)成功制備出CaMD130G（第130位天冬氨酸突變?yōu)楦拾彼幔┩蛔凅w蛋白，但其在LQTs發(fā)病過程中與心肌NaV1.5通道的結(jié)合及調(diào)節(jié)作用仍然未知。

本研究擬采用同源建模和分子對接的方法對CaM、CaMD130G與心肌NaV1.5通道IQ基序?qū)?，初步探索結(jié)合可能性。同時擬構(gòu)建、表達、制備與純化IQ蛋白，并初步探索其與CaMD130G的結(jié)合活性，為相關(guān)疾病的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6P-1/GST-IQ質(zhì)粒由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；胰蛋白胨和酵母提取物購自美國Oxid公司；異丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、氨芐西林（ampicillin，Amp）、溶菌酶（lysozyme，Lys）以及N-月桂酰肌氨酸（N-lauroylsarcosine sodium，N-lau）均購自美國Sigma公司；Triton X-100和磷酸鹽緩沖液（phosphate bufer，PBS）粉末購自北京Solarbio公司；Glutathione-Sepharose 4B beads（GS-4B beads）購自英國GE Healthcare 公司。

1.2 同源建模與蛋白對接

獲得心肌NaV1.5通道IQ基序和CaM及其突變體CaMD130G氨基酸序列（圖1），采用SWISS MODEL 數(shù)據(jù)庫進行同源建模與分子對接。通過PyMOL軟件讀取，修飾并分析對接結(jié)果。

1.3 融合蛋白GST-IQ的制備

圖1 心肌NaV1.5通道及CaMD130G的模式圖Fig.1 Schematic diagram of the cardiac NaV1.5 channel and CaMD130G

1.3.1 誘導(dǎo)與表達：將重組pGEX-6P-1/GST-IQ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞并放于含有Amp的1×LB培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，在90 r/min、37 ℃水浴的條件中振蕩培養(yǎng)12～16 h。當(dāng)光密度（optical density，OD）600處于0.6～1.2時向培養(yǎng)基中加入IPTG（終濃度為1 mmol/L），37 ℃、110 r/min 振蕩4 h，以誘導(dǎo)重組蛋白的表達。

1.3.2 蛋白提?。菏占T導(dǎo)表達重組IQ蛋白的菌液，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀。向其中加入PBS緩沖液重懸沉淀，依次加入20 mg/mL Lys（終濃度為0.1 mg/mL）、N-Lau（終濃度為1.5%）和1 mol/L DTT（終濃度為5 mmol/L）并混勻，于冰上靜置30 min。然后于冰上超聲破碎30 min，加入30%TritonX-100至1%混勻后再次靜置30 min，此后得到的細菌裂解液放入4 ℃恒溫離心機中15 000g高速離心10 min，得到IQ蛋白粗提液。

1.4 Pull-down結(jié)合實驗

在15 mL EP管中用PBS清洗GS-4B beads 3次（每次800 r/min，3 min離心），將提取的IQ蛋白加入到洗好的beads中，于4 ℃條件下過夜孵育。次日，用Tris buffer清洗3次，獲得GST-IQ蛋白。在2 mL EP管中加入GST-IQ蛋白40 μL，再依次加入相應(yīng)濃度的CaM/CaMD130G，使終濃度分別為2.1，3.5，7.0，10.0 μmol/L，然后向其中加入CaCl2至鈣離子（Ca2+）終濃度為10 μmol/L，再加入Tris Buffer至300 μL，然后于4 ℃的條件中緩慢旋轉(zhuǎn)孵育4 h。孵育后，清洗2遍。最后加入loading buffer，煮沸5 min，將獲得的結(jié)合蛋白進行15% SDS-PAGE電泳。

2 結(jié)果

2.1 CaMD130G蛋白與心肌NaV1.5通道IQ的同源建模與蛋白對接

在SWISS-MODEL網(wǎng)站中對心肌NaV1.5通道的IQ蛋白、CaM及其突變體CaMD130G蛋白成功建模，其中IQ蛋白和CaM的模型與目標(biāo)序列完全一致，同源性高達100%。而CaMD130G因為第130位點突變，只有1個氨基酸序列發(fā)生變化，所以模型同源性為99.45%。雖然CaMD130G在建模時空間結(jié)構(gòu)與CaM一致，但其結(jié)合Ca2+的數(shù)量減少。本研究結(jié)果顯示，正常CaM結(jié)合4個Ca2+，但突變體CaMD130G只結(jié)合3個Ca2+，在靠近C末端第130位氨基酸位點處丟失了1個Ca2+的結(jié)合。同時，研究發(fā)現(xiàn)無論是CaM還是CaMD130G在蛋白對接中都能與IQ 蛋白對接上，預(yù)測CaMD130G可與心肌NaV1.5有結(jié)合活性。見圖2。

2.2 重組心肌NaV1.5通道IQ質(zhì)粒和蛋白的制備

圖2 CaM/CaMD130G-IQ蛋白對接圖Fig.2 CaM/CaMD130G-IQ protein docking diagram

質(zhì)粒載體pGEX-6P-1堿基長約4 900 bp，酶切位點BamHⅠ和XhoⅠ之間的堿基全長約20 bp，IQ的堿基序列大小為135 bp，經(jīng)3’端和5’端雙酶切并插入IQ基因后整個重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/IQ全長約5 015 bp。重組質(zhì)粒EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切后獲得1個大分子量DNA（約為3 100 bp）和1個小分子量DNA（約為1 900 bp）。瓊脂糖凝膠電泳（圖3A）結(jié)果顯示，泳道1中約5 000 bp處的條帶是重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/IQ的堿基大小。泳道2中3 100 bp和2 900 bp處均可看到明顯的條帶，質(zhì)粒制備結(jié)果與理論值一致，證明心肌NaV1.5通道IQ質(zhì)粒構(gòu)建成功。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，再由IPTG誘導(dǎo)IQ蛋白的表達，采用超聲破碎法提取IQ蛋白并進行15% SDS-PAGE電泳，得到純度和濃度較高的IQ蛋白片段，見圖3B。

2.3 心肌NaV1.5通道IQ蛋白與CaMD130G結(jié)合作用的鑒定

圖3 重組心肌NaV1.5通道IQ質(zhì)粒與蛋白制備Fig.3 Recombinant cardiac NaV1.5 channel IQ plasmid and protein

圖4 CaM及CaMD130G與GST-IQ結(jié)合的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis of the binding between CaM/CaMD130Gand GST-IQ

Pull-down結(jié)合實驗結(jié)果顯示，在10.0 μmol/L Ca2+情況下，CaM和CaMD130G與心肌NaV1.5通道IQ蛋白均能結(jié)合，并且這種結(jié)合作用具有CaM和CaMD130G濃度依賴性，證明CaM和CaMD130G與心肌NaV1.5通道IQ蛋白具有很好的結(jié)合活性，見圖4。

3 討論

CaM作為一類胞內(nèi)高度保守的Ca2+結(jié)合蛋白，不僅參與體內(nèi)多種信號傳導(dǎo)，在Ca2+依賴性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中更是起著至關(guān)重要的作用。Ca2+對CaM具有重要的調(diào)節(jié)作用，CaM對Ca2+具有依賴性，是動態(tài)多功能Ca2+傳感器［14］。CaM有2個球型末端，每個末端含有2個Ca2+結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域能結(jié)合1個Ca2+，因此，每個CaM可以結(jié)合4個Ca2+。當(dāng)CaM與Ca2+結(jié)合后自身構(gòu)象發(fā)生改變，從而與目標(biāo)蛋白結(jié)合，調(diào)控靶蛋白的活性使其發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能［15］。最近的研究［16-18］發(fā)現(xiàn)CaM基因的某些位點突變在多種心血管系統(tǒng)疾病中扮演著重要角色，嚴重威脅人類生命健康。

NaV1.5通道由SCN5A基因編碼，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是決定心肌細胞興奮的關(guān)鍵因素，主要參與動作電位上升支形成和電沖動在心肌細胞間的傳導(dǎo)。研究［10，16，19］報道，CaM主要與NaV1.5通道的IQ基序相互作用，從而對通道功能進行調(diào)節(jié)。CaM某些位點發(fā)生突變，破壞了NaV1.5失活狀態(tài)的電壓依賴性和穩(wěn)定性，導(dǎo)致鈉電流異常，引起LQTs等疾病，可導(dǎo)致心臟驟停甚至出現(xiàn)心源性猝死等不良事件。目前，與LQTs有關(guān)的CaM的多個突變位點已經(jīng)被報道，如CaMD96V、CaME141G和CaMD130G等。有研究［20］證明CaME141G對心肌NaV1.5的調(diào)節(jié)的影響在LQTs中發(fā)揮重要作用。而對于CaMD130G與心肌NaV1.5的相互作用研究較少，探尋CaMD130G與心肌NaV1.5的結(jié)合作用對于研究LQTs等心臟疾病具有重要意義。本研究采用同源建模的方法對CaMD130G突變體進行建模，結(jié)果顯示，CaMD130G模型可能因為第130位氨基酸突變導(dǎo)致結(jié)合的Ca2+減少了1個，此結(jié)果提示該位點的突變可能會影響CaMD130G的Ca2+依賴性，改變CaMD130G對Ca2+的親和力，推測CaMD130G對心肌NaV1.5通道IQ基序的調(diào)節(jié)作用發(fā)生改變，最終可能導(dǎo)致LQTs等心臟疾病的發(fā)生。

以往研究［20］提示CaM與Ca2+結(jié)合特性的變化可能是CaM突變體引發(fā)LQTs的病理機制之一。本研究結(jié)果證明CaMD130G與心肌NaV1.5的IQ基序具有很好的結(jié)合活性，但是對其結(jié)合的Ca2+濃度依賴性和CaM濃度依賴性還不了解，需要進一步的實驗明確其詳細的結(jié)合模式，從而深入探討LQTs發(fā)病可能的詳細分子機制。本研究初步探索了CaMD130G與心肌NaV1.5的IQ的相互結(jié)合作用，為未來的深入研究奠定了堅實的基礎(chǔ)，并為探討LQTs的病理機制提供理論依據(jù)。