劉嘯白，王迪，劉云會

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004）

腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤的70%，5年生存率僅5%［1-2］。膠質(zhì)瘤是典型的血管依賴性實體腫瘤，其豐富的血液供應(yīng)是膠質(zhì)瘤浸潤性生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)［3］。隨著腫瘤血管新生研究的深入，貝伐單抗作為有效的抗血管生成藥物，在膠質(zhì)瘤治療中顯示出顯著的短期療效，但長期療效不佳［4］。因此，深入研究調(diào)控膠質(zhì)瘤血管生成機制具有重要的理論與應(yīng)用價值。

膠質(zhì)瘤干細胞（glioma stem cells，GSCs）是具有自我更新和多向分化能力的細胞。最近的研究［5］表明GSCs能夠形成血管生成擬態(tài)。血管生成擬態(tài)是獨立于微血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成的微血管系統(tǒng)，針對GSCs血管生成擬態(tài)的分子靶向治療成為膠質(zhì)瘤治療研究的熱點。核仁小RNA（small nucleolar RNAs，snoRNAs）主要分布于真核生物細胞核仁，具有多種生物學功能［6］。促紅細胞生成素肝細胞受體A2（erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2）是促進血管生成擬態(tài)形成的重要因子，它通過調(diào)控細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）激活磷酸肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3’-OH kinase，PI3K），進而調(diào)控血管生成擬態(tài)的形成［7］。本研究擬探討SNORA31抑制GSCs血管生成擬態(tài)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 GSCs的培養(yǎng)與鑒定

參考奚卓等［8］的研究方法，采用中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科膠質(zhì)母細胞瘤患者術(shù)中切除的腫瘤組織，PBS緩沖液洗滌腫瘤組織、剪碎，DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)獲得膠質(zhì)母細胞瘤細胞。胰蛋白酶對培養(yǎng)的細胞進行消化，收集細胞，并使用GSCs培養(yǎng)液 ［含2% B27，10 ng/mL 堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），10 ng/mL表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）］重懸，培養(yǎng)并獲得GSCs。本實驗已獲得中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院倫理委員會批準。患者術(shù)前已簽署知情同意書。

1.2 敲減SNORA31的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

構(gòu)建敲減SNORA31（sh-SNORA31）質(zhì)粒及其非靶向結(jié)合序列（sh-NC，陰性對照）質(zhì)粒（中國GenePharma公司）。使用Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑混合將質(zhì)粒分別在GSCs中轉(zhuǎn)染。進一步通過梯度加入0.2 mg/mL G418（加藥1次/24 h，最高至2 mg/mL）篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GSCs細胞，應(yīng)用qRT-PCR方法檢測SNORA31的表達，明確轉(zhuǎn)染效率。

1.3 Western blotting檢測

PBS緩沖液清洗GSCs 3次，使用RIPA裂解緩沖液從GSCs中提取蛋白。進一步通過電泳（恒壓80 V）以及轉(zhuǎn)?。ê懔?20 mA）將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。使用5%脫脂牛奶在室溫封閉2 h，然后與相應(yīng)一抗4 ℃條件下孵育過夜，具體如下：EphA2（1 ∶500，美國Santa Cruz Biotechnology公司）、ERK 1/2（1 ∶1 000，美國Santa Cruz Biotechnology公司）、p-ERK 1/2（1 ∶500，美國Santa Cruz Biotechnology公司）、p-PI3K（1 ∶500，美國Santa Cruz Biotechnology公司）、PI3K（1 ∶1 000，美國Santa Cruz Biotechnology公司）、GAPDH（1 ∶10 000，中國Proteintech公司）。第2天TTBS將膜洗滌3次，每次5 min，然后與相應(yīng)二抗常溫條件下孵育2 h，具體如下：山羊抗兔（1 ∶10 000，中國Proteintech公司）或山羊抗小鼠（1 ∶10 000，中國Proteintech公司）。TTBS將膜洗滌3次，每次5 min。最后應(yīng)用ChemImager 5500軟件進行掃描，使用發(fā)光試劑盒觀察免疫印跡，使用灰度分析軟件檢測并計算相對灰度值（integrated density values，IDV）。

1.4 GSCs增殖能力檢測

將收集的GSCs按照3×103/孔接種于96孔板，細胞恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。然后在各組對應(yīng)的孔中加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)在細胞恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h。最后使用SpectraMax M5酶標儀（美國Molecular Devices公司）測量450 nm處的吸光度來檢測GSCs的細胞增殖能力。

1.5 GSCs遷移和侵襲能力檢測

應(yīng)用Transwell方法檢測細胞的遷移和侵襲能力。將收集的GSCs按1×105/mL懸浮于200 μL無血清培養(yǎng)基中，接種于上室（不含Matrigel基質(zhì)膠，用于細胞遷移能力檢測）或接種于預(yù)先涂有Matrigel基質(zhì)膠的上室（含Matrigel基質(zhì)膠，用于細胞侵襲能力檢測）中，同時將配制含10%胎牛血清的GSCs培養(yǎng)基添加到下室，分別進行細胞遷移、侵襲能力的檢測分析。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室并用甲醇和冰醋酸（3 ∶1）對膜表面細胞進行固定（30 min）。進一步使用10% Giemsa染色液在室溫避光條件下染色4 h以上。最后在顯微鏡下統(tǒng)計并拍照（選擇5個隨機視野計數(shù)細胞數(shù)）。

1.6 基質(zhì)膠三維管形成實驗

應(yīng)用基質(zhì)膠三維管形成實驗檢測細胞的血管生成擬態(tài)能力。將收集的GSCs按60×104/mL懸浮于100 μL無血清培養(yǎng)基中，接種于鋪有100 μL Matrigel基質(zhì)膠的96孔板上。細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后在顯微鏡下統(tǒng)計并拍照。

1.7 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用表示。組間比較采用t檢驗、秩和檢驗或單因素方差分析，組間兩兩比較進行Bonferroni檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SNORA31在中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜（Chinese glioma genome atlas，CGGA）數(shù)據(jù)庫（http：//www.cgga.org.cn/）中的生存分析和GSCs中的表達

圖1 CGGA數(shù)據(jù)庫中的生存分析及GSCs中SNORA31的表達Fig.1 Survival analysis of data from the CGGA database and SNORA31 expression in GSCs

CGGA數(shù)據(jù)庫中生存分析結(jié)果顯示，SNORA31的高表達與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。為了進一步明確GSCs中SNORA31的表達，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與親本細胞組（1.00±0）比較，GSCs（5.11±1.58）中SNORA31表達顯著增多（P＜ 0.05）。見圖1。

2.2 敲減SNORA31對GSCs中EphA2表達、p-ERK1/2/ERK1/2、p-PI3K/ PI3K比值的影響

qRT-PCR方法檢測敲減SNORA31的轉(zhuǎn)染效率，Western blotting檢測敲減SNORA31對GSCs中EphA2、p-ERK1/2/ ERK1/2、p-PI3K/ PI3K表達的作用。結(jié)果顯示，與sh-NC組比較，sh-SNORA31組EphA2表達，p-ERK1/2/ERK1/2、p-PI3K/PI3K比值均顯著降低（均P＜ 0.01）。見圖2。

2.3 敲減SNORA31對GSCs血管生成擬態(tài)的作用

圖2 敲減SNORA31對GSCs中血管生成擬態(tài)相關(guān)分子表達的影響Fig.2 Effect of SNORA31 knockdown on the levels of molecules related to the vasculogenic mimicry of GSCs

CCK8實驗檢測結(jié)果顯示，敲減SNORA31可顯著抑制GSCs的增殖。Transwell實驗結(jié)果顯示，敲減SNORA31顯著抑制GSCs的遷移和侵襲?；|(zhì)膠三維管形成實驗結(jié)果顯示，敲減SNORA31顯著抑制GSCs的血管生成擬態(tài)能力。見圖3。

圖3 敲減SNORA31對GSCs增殖、遷移、侵襲和血管生成擬態(tài)的影響Fig.3 Effects of SNORA31 knockdown on proliferation，migration，invasion，and vasculogenic mimicry of GSCs

3 討論

GSCs是膠質(zhì)瘤細胞中的重要亞群，它具有自我更新、低分化、多向分化能力等特點。目前，腫瘤細胞提取干細胞主要有2個方案：（1）腫瘤細胞系的培養(yǎng)與干細胞鑒定；（2）通過臨床上獲取新鮮的人原代腫瘤組織分離培養(yǎng)后進行干細胞鑒定。由于第2種方案來源于人原代腫瘤細胞，實驗結(jié)論更具可信性，因此本研究采用這類細胞進行研究。

snoRNAs是廣泛存在于真核細胞核仁的小分子非編碼RNA，由內(nèi)含子編碼，長度60～300 nt。snoRNAs根據(jù)含有保守結(jié)構(gòu)元件的不同種類分為C/D snoRNAs、H/ACA snoRNAs和MRP RNA。snoRNAs在核糖體RNA修飾方面發(fā)揮重要的功能。研究［6］表明，snoRNAs表達失調(diào)能夠調(diào)節(jié)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SNORD76在膠質(zhì)母細胞瘤中低表達，過表達SNORD76抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖能力［9］。SNORA42調(diào)控大腸癌細胞的增殖能力與分化能力，并且已經(jīng)成為預(yù)測大腸癌患者復(fù)發(fā)和預(yù)后的生物學標志物［10］。本研究在CGGA數(shù)據(jù)庫中的生存分析結(jié)果顯示，SNORA31的表達水平與患者的生存期顯著相關(guān)，進一步對GSCs中SNORA31表達的檢測結(jié)果表明，SNORA31在GSCs中高表達。因此，本研究對SNORA31在GSCs中的作用進行研究。

EphA2是Eph受體酪氨酸激酶亞家族的成員之一，可以通過直接的細胞間相互作用與膜結(jié)合的ephrin配體相互作用，進而導(dǎo)致信號通路的雙向激活。EphA2在胚胎組織和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及維持成人體內(nèi)細胞增殖、血管生成和干細胞分化等生物學進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［11］。腫瘤相關(guān)研究［12-16］發(fā)現(xiàn)EphA2的異常表達與膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等密切相關(guān)。敲減EphA2能夠在體外抑制黑色素瘤的血管生成擬態(tài)［17］。EphA2通過FAK驅(qū)動ERK1/2的磷酸化，激活血管生成擬態(tài)的形成［18］。在胃癌中，腫瘤相關(guān)成纖維細胞通過EphA2-PI3K信號傳導(dǎo)促進胃癌細胞的血管生成擬態(tài)形成［19］。本研究檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲減SNORA31的GSCs中EphA2表達與p-ERK1/2/ ERK1/2、p-PI3K/ PI3K比值均顯著降低；CCK8實驗、Transwell實驗及基質(zhì)膠三維管形成實驗結(jié)果顯示敲減SNORA31顯著抑制GSCs的增殖、遷移、侵襲、血管生成擬態(tài)。

綜上所述，敲減SNORA31抑制了EphA2的表達及ERK1/2、PI3K的磷酸化，進而抑制了GSCs的增殖、遷移、侵襲和血管生成擬態(tài)的形成。提示SNORA31可能成為膠質(zhì)母細胞瘤治療的潛在靶點。