蘇 凱，楊彥楠，楊欣剛

膠質(zhì)瘤亦稱(chēng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤，是顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，年發(fā)病率為4/10萬(wàn)～5/10萬(wàn)，具有惡性程度高、治愈率低、預(yù)后差等特點(diǎn)[1,2]。目前,手術(shù)治療是最直接、有效的治療方式，但患者近5年整體生存率仍低于10%[3]。因此，尋找一種安全有效的方法成為臨床上亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)，保護(hù)神經(jīng)元免受損傷和誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤侵襲能力成為治療膠質(zhì)瘤的突破口。異丙酚又稱(chēng)丙泊酚或普魯泊福，是臨床常用的靜脈麻醉藥，具有起效快、蘇醒迅速、分布快、持續(xù)靜注后無(wú)蓄積等特點(diǎn)。最新研究證實(shí)，異丙酚有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，可通過(guò)抗氧化、抗炎、抗凋亡等不同機(jī)制減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷，發(fā)揮器官保護(hù)作用[4-6]。Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號(hào)通路是細(xì)胞因子激活相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有研究表明JAK2/STAT3信號(hào)通路可參與神經(jīng)元的增殖、生存、分化過(guò)程，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂疾病中的炎性反應(yīng)病理過(guò)程，與腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切[7，8]。但異丙酚能否影響膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路還尚未研究。本研究擬通過(guò)用MTT法、Transwell模型、劃痕實(shí)驗(yàn)和Western blotting法研究異丙酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及JAK2/STAT3通路的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 異丙酚注射液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；MTT試劑、Transwell板、Matrigel購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人JAK2、兔抗人STAT3、兔抗人p-JAK2、兔抗人p-STAT3、兔抗人內(nèi)參β-Actin、羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司。SC-Y408A光學(xué)顯微鏡購(gòu)自深圳市晨晟光學(xué)儀器有限公司；Thermo賽默飛世爾FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；BPH-9042細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自蘇州諾微爾電子科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)接種專(zhuān)用超凈臺(tái)購(gòu)自鄭州安晟科學(xué)儀器有限公司；電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞購(gòu)自上海信裕生物工程有限公司；人正常星型膠質(zhì)細(xì)胞HEB購(gòu)自上海奧陸生物科技有限公司。將膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞和人正常星型膠質(zhì)細(xì)胞HEB按常規(guī)培養(yǎng)在含有10%血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2、相對(duì)濕度98%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，長(zhǎng)至80%時(shí)傳代，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞、人正常星型膠質(zhì)細(xì)胞HEB，用培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，以每孔200 μl接種到96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜后棄培養(yǎng)液，并用PBS清洗3遍，加入濃度為5、10、25、50、100 μM的異丙酚培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)副孔，同時(shí)設(shè)置只加0.1%DMSO組，不加異丙酚的對(duì)照組。培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，之后加入MTT溶液(5 mg/ml)25 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO溶液，37 ℃，100 r/min震蕩10 min，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處吸光度(optical density，OD值)。計(jì)算不同濃度異丙酚對(duì)U87細(xì)胞和HEB細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 將Matrigel從-20 ℃冰箱中取出，置于4 ℃條件下過(guò)夜解凍，用無(wú)血清的培養(yǎng)液稀釋至200 μl/ml，之后涂抹到transwell板的濾膜上面(200 μl/cm2)，37 ℃放置3 h，取出后在超凈臺(tái)上干燥過(guò)夜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，用無(wú)血清的培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，以每孔200 μl接種到transwell上室，下室加入600 μl含10%血清的培養(yǎng)液，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換上室培養(yǎng)液，設(shè)置對(duì)照組和2、5、10 μM異丙酚組。培養(yǎng)48 h，用棉簽輕輕擦去Matrigel和上室內(nèi)細(xì)胞，10%甲醛溶液固定15 min，用蒸餾水清洗3次，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，蒸餾水清洗3次，每組設(shè)置6個(gè)副孔。顯微鏡下拍照，隨機(jī)選擇6個(gè)視野計(jì)數(shù)，結(jié)果取平均值。用穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)相對(duì)于相應(yīng)孔中細(xì)胞數(shù)比例表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，用培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，以每孔2 ml接種到6孔板，置于培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞單層平鋪70%～80% 時(shí)，用無(wú)菌的200 μl槍頭垂直于孔底，均勻劃出細(xì)胞劃痕，之后用PBS清洗除去細(xì)胞碎片，加入經(jīng)處理過(guò)的無(wú)血清培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組加入含終濃度分別為2、5、10 μM異丙酚的培養(yǎng)液，對(duì)照組培養(yǎng)液不經(jīng)任何處理，每組設(shè)置6個(gè)副孔，48 h后用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的遷移程度并拍照，遷移能力按下式計(jì)算：遷移能力(%)=(初始兩側(cè)距離-觀察時(shí)兩側(cè)距離)/初始兩側(cè)距離×100%。

1.6 Western blot檢測(cè) 蛋白印跡法(western blotting，WB)測(cè)定膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞JAK2和STAT3表達(dá)情況，設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(2、5、10 μM異丙酚分別作用U87細(xì)胞48 h)。用細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白含量，每組設(shè)置六個(gè)副孔。每個(gè)點(diǎn)樣孔加入50 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離目標(biāo)蛋白,根據(jù)目標(biāo)蛋白大?。篔AK2(130 ku)，p-JAK2(125 ku)，STAT3(86 ku)，p-STAT3(92 ku)剪切大小適當(dāng)?shù)哪z。將凝膠上的蛋白以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用5%的脫脂奶粉封閉膜上結(jié)合位點(diǎn)1 h。加入兔抗人JAK2(1∶1000)、兔抗人STAT3(1∶1000)、兔抗人p-JAK2(1∶1000)、兔抗人p-STAT3(1∶1000)、兔抗人內(nèi)參β-Actin(1∶1000)4 ℃孵育過(guò)夜，用PBS清洗3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗(1∶1000)，25℃孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min，用顯色劑ECL顯色、曝光。用凝膠成像設(shè)備觀察。

2 結(jié) 果

2.1 生長(zhǎng)抑制作用 MTT法測(cè)定不同濃度異丙酚處理48 h后，與對(duì)照組相比，5、10、25、50、100 μM異丙酚均能顯著抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖，并具有濃度依賴(lài)性，異丙酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞作用48 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為45.06 μM。與人正常星型膠質(zhì)細(xì)胞HEB組相比，同濃度下異丙酚對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞抑制率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 不同濃度異丙酚作用48 h后對(duì)U87細(xì)胞和HEB細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

2.2 體外侵襲和遷移能力的影響 與對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后，通過(guò)Matrigel到達(dá)濾膜底層的細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著異丙酚濃度的增大，其侵襲能力也隨著降低。與對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后，遷移能力分別降低(19.69±2.67)%、(41.41±3.28)%、(59.75±2.91)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 不同濃度異丙酚對(duì)U87細(xì)胞體外侵襲和遷移能力的影響

2.3 JAK2/STAT3通路的影響 與對(duì)照組相比，經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 不同濃度異丙酚對(duì)U87細(xì)胞JAK2和STAT3表達(dá)水平的影響

3 討 論

目前，膠質(zhì)瘤是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，放化療耐受、浸潤(rùn)生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因[9]。如何能有效抑制膠質(zhì)瘤侵襲、遷移和復(fù)發(fā)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一，研究表明多種信號(hào)通路分子參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲過(guò)程，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與胞外基質(zhì)相互作用，可以分泌基質(zhì)降解酶，導(dǎo)致正常腦組織局部降解，形成侵襲生長(zhǎng)[10，11]。

異丙酚是一種對(duì)細(xì)胞免疫功能無(wú)損傷的靜脈麻醉藥，具有脂溶性高、清除迅速的特點(diǎn)。研究表明異丙酚能夠增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的活性，經(jīng)異丙酚處理后的腫瘤細(xì)胞，其增殖、侵襲、遷移能力明顯受到抑制[12]。異丙酚能夠顯著上調(diào)miR-218的表達(dá)水平，下調(diào)MMP-2蛋白表達(dá)水平，抑制人膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。張永強(qiáng)等[14]研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可通過(guò)下調(diào)MMP-2蛋白表達(dá)水平來(lái)抑制肺癌癌細(xì)胞的增殖、侵襲，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。文獻(xiàn)[15]發(fā)現(xiàn)，異丙酚同樣可調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路作用于癌細(xì)胞，可能通過(guò)阻止P13K/AKt信號(hào)通路的激活，抑制人肝癌細(xì)胞的侵襲能力。閔娜等[16]發(fā)現(xiàn)，異丙酚能夠抑制人肝癌細(xì)胞增殖、侵襲能力，可能是通過(guò)阻止Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞與不同濃度異丙酚共同孵育48 h后，與對(duì)照組相比，5、10、25、50、100 μM異丙酚均能明顯抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖，半數(shù)抑制濃度(IC50)為45.06 μM，與人正常星型膠質(zhì)HEB細(xì)胞組相比，同濃度下異丙酚對(duì)U87細(xì)胞抑制率顯著升高，說(shuō)明異丙酚在5～100 μM濃度范圍內(nèi)能夠抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖，且對(duì)人正常星膠質(zhì)HEB細(xì)胞無(wú)毒性。

本研究MTT實(shí)驗(yàn)顯示，10 μM異丙酚作用48 h后對(duì)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞抑制率為(17.31±2.08)%，細(xì)胞活力超過(guò)80%，為防止細(xì)胞活力過(guò)低導(dǎo)致Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，后續(xù)選取異丙酚濃度2、5、10 μM進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后，能夠通過(guò)Matrigel到達(dá)濾膜底層的細(xì)胞數(shù)明顯減少，說(shuō)明10 μM異丙酚能夠抑制腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞體外侵襲能力。進(jìn)一步遷移實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞遷移能力明顯降低，說(shuō)明10 μM異丙酚能夠抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞體外遷移能力。異丙酚能夠抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，但具體通過(guò)何種細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控還待進(jìn)一步研究。

JAK/STAT信號(hào)通路分別由JAK蛋白家族和STAT蛋白家族組成，是體內(nèi)重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑，可在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎性反應(yīng)等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究表明，JAK2/STAT3信號(hào)通路與腦缺血再灌注損傷炎性反應(yīng)相關(guān)[17]。脊髓神經(jīng)受損會(huì)大量分泌IL-6，同時(shí)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，引起促炎因子、NO、誘導(dǎo)型活性氧簇釋放。郭佳培等[18]研究表明，青蒿素能夠阻斷JAK2/STAT3激活誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用，隨后胡兵等[19]研究發(fā)現(xiàn)阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路激活可抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)2、5、10 μM異丙酚處理48 h后的膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中JAK2蛋白磷酸化水平、STAT3蛋白磷酸化水平均明顯下調(diào)，呈濃度依賴(lài)效應(yīng)，說(shuō)明經(jīng)異丙酚處理可能抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞JAK2蛋白、STAT3蛋白磷酸化，從而阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路激活。

綜上所述，異丙酚可能通過(guò)阻斷JAK2/STAT3信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。但異丙酚與JAK2/STAT3信號(hào)通路作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。