李 林 劉 晶 王 景 楊 睿

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊 050000)

與其他惡性腫瘤一樣，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生是原癌基因活化和抑癌基因失活等因素相互作用的復(fù)雜而緩慢的過程，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，深入研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)預(yù)防其發(fā)生發(fā)展、早期診斷、靶向治療等具有積極作用[1，2]。LncRNA CCAT1在乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，被認(rèn)為是一種致癌基因，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[3，4]。關(guān)于LncRNA CCAT1在子宮內(nèi)膜癌中的研究較少，Yu等[5]研究發(fā)現(xiàn)CCAT1在子宮內(nèi)膜癌組織和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。但LncRNA CCAT1通過何種機(jī)制在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。本文對(duì)CCAT1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、凋亡和PI3K/AKT信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，探討CCAT1在子宮內(nèi)膜癌生長(zhǎng)中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞珠HEC-1-A和正常人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系T-HESC(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、TRIzol試劑、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Sigma公司)；胰蛋白酶、CCK8試劑、DMEM培養(yǎng)基(美國BPB公司)；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體、兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase 3)單克隆抗體、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體、兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人AKT單克隆抗體、兔抗人磷酸化AKT(p-AKT)單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；Lipofectamine 2000試劑盒(美國Invitrogen公司)；CCAT1模擬物siRNA(CCAT1-siRNA)和NC模擬物siRNA(NC)(廣州博銳生物科技公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國Gibco公司)；iNark酶標(biāo)儀和ZE5流式細(xì)胞儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR測(cè)定HEC-1-A和T-HESC細(xì)胞中CCAT1水平 TRIzol法提取HEC-1-A和T-HESC細(xì)胞總RNA ，分光光度計(jì)測(cè)定HEC-1-A和T-HESC細(xì)胞RNA濃度和純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參，PCR測(cè)定HEC-1-A和T-HESC細(xì)胞中CCAT1水平，CCAT1上游引物：5′-CCATTCCATTCATTTCTCTTTCCTA-3′，下游引物：5′-GGCGTAGGCGATTGGGGATCG-3′。PCR反應(yīng)條件為95℃ 20 s；95℃ 10 s，56℃ 30 s，共38個(gè)循環(huán)。每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。CCAT1水平以2-ΔΔCt表示。

1.2.2細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEC-1-A細(xì)胞，分為空白對(duì)照組(BC)、陰性對(duì)照組(NC)和CCAT1-siRNA組，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染。取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1-A細(xì)胞接種于6孔板(2×105個(gè)/孔)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%以上融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，CCAT1-siRNA組轉(zhuǎn)染CCAT1-siRNA，NC組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，BC組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后RT-PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染效率(即各組HEC-1-A細(xì)胞中CCAT1水平)，方法同1.2.1。

1.2.3CCK8測(cè)定HEC-1-A細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)良好的各組細(xì)胞接種于96孔板(5×103個(gè)/孔)，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)加入CCK8試劑(10 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔細(xì)胞光密度(OD)值。每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HEC-1-A細(xì)胞凋亡 取各組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×104個(gè)/ml，2 000 r/min離心10 min，PBS洗滌，75%乙醇處理后加入Binding Buffer緩沖液200 μl重懸細(xì)胞，再加入5 μl膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素(Annexin-V-FITC)和10 μl碘化丙啶處理30 min，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HEC-1-A細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western blot測(cè)定HEC-1-A細(xì)胞PCNA、clea-ved caspase 3、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平 取轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取HEC-1-A細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定HEC-1-A細(xì)胞蛋白濃度。取100 μg上清蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗人PCNA單克隆抗體、兔抗人cleaved caspase 3單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人AKT單克隆抗體、兔抗人p-AKT單克隆抗體，稀釋比例1∶ 300，孵育過夜。加入二抗(1∶ 5 000)孵育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用凝膠電泳成像儀采集圖像，Quantity One軟件分析各蛋白條帶灰度值。目標(biāo)蛋白水平以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1CCAT1在HEC-1-A細(xì)胞中的表達(dá) HEC-1-A細(xì)胞中CCAT1水平(2.15±0.24)高于T-HESC細(xì)胞(1.00±0.13)(t=11.147，P<0.001)。見圖1。

2.2CCAT1-siRNA對(duì)HEC-1-A細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 與BC組和NC組相比，CCAT1-siRNA組HEC-1-A細(xì)胞中CCAT1水平降低(P<0.05)，BC組和NC組HEC-1-A細(xì)胞中CCAT1水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

2.3CCAT1-siRNA對(duì)HEC-1-A細(xì)胞增殖的影響 24 h時(shí)3組HEC-1-A細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；48 h和72 h時(shí)與BC組和NC組相比，CCAT1-siRNA組HEC-1-A細(xì)胞中增殖率降低(P<0.001)，BC組和NC組HEC-1-A細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4CCAT1-siRNA對(duì)HEC-1-A細(xì)胞凋亡的影響 與BC組和NC組相比，CCAT1-siRNA組HEC-1-A細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，BC組和NC組HEC-1-A細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖3。

圖1 HEC-1-A和T-HESC細(xì)胞中CCAT1水平Fig.1 CCAT1 levels in HEC-1-A and T-HESC cellsNote:Compared with HEC-1-A group,*.P<0.05.

表1 各組HEC-1-A細(xì)胞CCAT1水平和細(xì)胞凋亡率

2.5CCAT1-siRNA對(duì)HEC-1-A細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白的影響 與BC組和NC組相比，CCAT1-siRNA組HEC-1-A細(xì)胞中PCNA和Bcl-2蛋白水平降低(P<0.001)，cleaved caspase 3和Bax蛋白水平升高(P<0.001)，BC組和NC組HEC-1-A細(xì)胞中PCNA、cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖4。

2.6CCAT1-siRNA對(duì)HEC-1-A細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 3組HEC-1-A細(xì)胞AKT蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與BC組和NC組相比，CCAT1-siRNA組HEC-1-A細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白水平降低(P<0.001)，BC組和NC組HEC-1-A細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖5。

表2 各組HEC-1-A細(xì)胞增殖率比較

圖3 各組HEC-1-A細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis of HEC-1-A cells in each groupNote:Compared with BC group,*.P<0.05,compared with NC group,#.P<0.05.

圖4 各組HEC-1-A細(xì)胞PCNA、cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)Fig.4 Expressions of PCNA,cleaved caspase 3,Bax and Bcl-2 proteins in HEC-1-A cells of each groupNote:1.BC group；2.NC group；3.CCAT1-siRNA group.

表3 各組HEC-1-A細(xì)胞PCNA、cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白水平比較

表4 各組HEC-1-A細(xì)胞PI3K、AKT、p-AKT蛋白水平比較

圖5 各組HEC-1-A細(xì)胞PI3K、AKT、p-AKT蛋白Western blot電泳圖Fig.5 Western blot analysis of PI3K，AKT and p-AKT proteins in HEC-1-A cells of each groupNote:1.BC group；2.NC group；3.CCAT1-siRNA group.

3 討論

LncRNA空間結(jié)構(gòu)多樣、序列長(zhǎng)、功能復(fù)雜，可以從表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控3個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)[6]。LncRNA可影響細(xì)胞的增殖和凋亡信號(hào)通路，影響惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。目前發(fā)現(xiàn)多種LncRNA與惡性腫瘤關(guān)系密切，根據(jù)LncRNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲遷移中的作用分為促進(jìn)腫瘤發(fā)生的LncRNA和抑制腫瘤發(fā)生的LncRNA[8]。LncRNA CCAT1最早在結(jié)腸癌組織中被發(fā)現(xiàn)明顯升高，可通過升高N-鈣黏素水平和降低E-鈣黏素水平促進(jìn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞極性丟失，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[9]。后來研究發(fā)現(xiàn)CCAT1在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，并通過多種信號(hào)通路參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10-12]。余南榮等[13]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA CCAT在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制LncRNA CCAT表達(dá)通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。CCAT在子宮內(nèi)膜癌中的作用也受到廣泛關(guān)注，Yu等[5]研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中CCAT1水平升高，敲低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中CCAT1水平可通過miR-181a-5p抑制子宮內(nèi)膜癌增殖和遷移。本文通過沉默子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-A中CCAT1水平，發(fā)現(xiàn)沉默子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中CCAT1水平可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果和Yu等[5]的研究結(jié)果一致，表明CCAT1可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制尚不明確。

細(xì)胞的增殖和凋亡失調(diào)是引起子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡受多種信號(hào)通路調(diào)控。PI3K/AKT通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌中PI3K/AKT通路激活，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展，抑制PI3K/AKT通路激活可抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展[15，16]。PI3K/AKT信號(hào)通路下游有多種效應(yīng)分子，其中AKT是該通路下游的直接底物，磷酸化的AKT可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[17]。

LncRNA CCAT1可通過多種信號(hào)通路參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)CCAT1在甲狀腺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，推測(cè)CCAT1可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。本研究表明沉默LncRNA CCAT1可降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PCNA、Bcl-2、PI3K和p-AKT蛋白水平，提高cleaved caspase 3和Bax蛋白水平。PCNA在惡性腫瘤細(xì)胞和增殖細(xì)胞中存在，和細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，是細(xì)胞異常增殖的關(guān)鍵蛋白，在子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，可反映子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖情況[19]。Bcl-2為抑癌基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用[20]。Bax為Bcl-2家族基因，為人體主要的凋亡基因，對(duì)Bcl-2起抑制作用，為重要的促細(xì)胞凋亡基因[21]。Caspase途徑在惡性腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，caspase 3為其級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的主要蛋白酶，在惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主導(dǎo)作用，為死亡執(zhí)行蛋白酶，caspase 3活化后可使細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段，是惡性腫瘤細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[22]。本研究沉默LncRNA CCAT1后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PCNA、Bcl-2蛋白水平降低，cleaved caspase 3和Bax蛋白水平升高，表明沉默LncRNA CCAT1可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。沉默CCAT1后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PI3K和p-AKT蛋白水平降低，表明沉默CCAT1可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路激活。推測(cè)沉默CCAT1可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LncRNA CCAT1參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能與LncRNA CCAT1可影響PI3K/AKT信號(hào)通路的激活有關(guān)。