韓世紀(jì) ，練國(guó)達(dá) ，陳少杰 ，黃開(kāi)紅 *，李佳佳

胰腺癌惡性程度高，腫瘤間質(zhì)纖維化是其重要病理特征，纖維化程度與不良預(yù)后相關(guān)［1］。胰腺癌結(jié)締組織致密壓迫血管造成組織內(nèi)有效灌注少，組織本身血管分布較少、缺氧明顯，極大地限制了組織局部的化療藥物濃度及藥效發(fā)揮，給胰腺癌治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)［2，3］。胰腺纖維化的形成是一個(gè)由復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、以胰腺星形細(xì)胞（pancreatic stellate cells，PSCs）活化為中心、多種細(xì)胞因子參與、最終以成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積為特征的復(fù)雜病理發(fā)展過(guò)程［4］。當(dāng)胰腺損傷或發(fā)生病變（如慢性胰腺炎或胰腺癌等）時(shí)，PSCs 被激活為肌成纖維樣細(xì)胞，增殖活躍、脂質(zhì)成分減少、表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和結(jié)蛋白（desmin），以α-SMA 為較公認(rèn)的PSCs 活化標(biāo)志。在其活化過(guò)程中，伴隨過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白比如Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ、Ⅱ）、纖維結(jié)合蛋白（Fibronectin）表達(dá)，基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）及其抑制劑的合成，這些基質(zhì)成分也是導(dǎo)致胰腺癌耐藥的重要原因之一［4，5］。

近年來(lái)，PSCs 相關(guān)研究越來(lái)越多，但大部分實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞主要來(lái)源于小鼠或大鼠胰腺分離的PSCs，僅有部分實(shí)驗(yàn)使用組織塊outgrowth 培養(yǎng)法獲得原代培養(yǎng)的人 PSCs（human PSCs，hPSCs）［6-12］。由于胰腺組織來(lái)源有限，原代培養(yǎng)條件復(fù)雜且耗時(shí)，純化得到的原代細(xì)胞持續(xù)分裂能力有限，多使用第3 代至第 8 代［12，13］；并且由于同一標(biāo)本所得 PSCs 難以持續(xù)分裂足夠細(xì)胞用于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)；而不同組織標(biāo)本來(lái)源PSCs 異質(zhì)性較大，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致性和可靠性差。隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，永生化建細(xì)胞系技術(shù)逐漸成為構(gòu)建預(yù)期表型細(xì)胞系的重要手段之一。所謂的“永生化”是指培養(yǎng)細(xì)胞在體外能穩(wěn)定傳代、生長(zhǎng)，但又不發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，即不具有癌細(xì)胞的特征。為了彌補(bǔ)目前PSCs 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來(lái)源不足的缺陷，國(guó)外有部分實(shí)驗(yàn)室報(bào)道采取慢病毒轉(zhuǎn)染的方法建立了鼠 PSCs（mice PSC，mPSC）和hPSCs 永生化細(xì)胞系［14-16］。早期永生化建系時(shí)，單獨(dú)使用猿猴病毒 40（Simian virus 40，SV40）轉(zhuǎn)染獲得的永生化細(xì)胞效率較低［17］。為克服細(xì)胞分裂過(guò)程中端?？s短現(xiàn)象，在正常細(xì)胞中導(dǎo)入端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶催化亞基基因（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是目前用于維持端粒結(jié)構(gòu)完整和穩(wěn)定的最有效途徑，可防止細(xì)胞復(fù)制性衰老，使正常上皮細(xì)胞永生化［18-20］；近年來(lái)聯(lián)合SV40T 抗原基因和hTERT 基因己成功用于人乳腺成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，瞼板腺上皮細(xì)胞等細(xì)胞永生化建系［21，22］。

本部分實(shí)驗(yàn)中，我們使用重組慢病毒將SV40LT基因和hTERT 基因?qū)朐鷋PSCs 中，通過(guò)抗性藥物篩選及擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞免疫熒光、Western blot和qRT-PCR、染色體核型分析、生長(zhǎng)曲線測(cè)定、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)等研究其表型，建立一株人胰腺星形細(xì)胞永生化細(xì)胞系；并將該細(xì)胞系與胰腺癌細(xì)胞在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，證實(shí)其生物學(xué)功能。為胰腺星形細(xì)胞相關(guān)研究提供充足細(xì)胞來(lái)源，以保證后續(xù)科研工作的進(jìn)一步開(kāi)展。

1 材料與方法

1.1 采用outgrowth 方法培養(yǎng)原代PSCs

1例胰腺癌組織標(biāo)本來(lái)自于2020年5月我院肝膽外科手術(shù)切除，病理診斷為高分化胰腺導(dǎo)管腺癌標(biāo)本，利用outgrowth 法培養(yǎng)獲得。具體步驟如下：標(biāo)本由含有青霉素/鏈霉素的PBS 沖洗，剪成直徑2～3 mm 組織塊，種植于含有10%FBS（Gibco，CA，USA）及 2 mmol/L 谷氨酰胺的 DMEM/F-12（1∶1）（Gibco，CA，USA）培養(yǎng)基的六孔板中，每孔3～5 塊組織，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；24 h 換液，48 h 換板，后 2～3 天換液，5～7 天 hPSCs 生長(zhǎng)出組織塊并附壁于孔板。至細(xì)胞密度達(dá)到約80%～90%，胰酶消化后傳代。

1.2 SV40LT 和hTERT 重組慢病毒轉(zhuǎn)染及永生化細(xì)胞篩選

挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代hPSCs，以5×104/mL接種于96 孔板，使用DMEM/F-12 完全培養(yǎng)基稀釋pdybrene 至終濃度50 μg/mL；更換培養(yǎng)基加入SV40LT 和hTERT 病毒液（上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司）進(jìn)行細(xì)胞感染，為im PSCs 組，陰性對(duì)照組為NC PSCs 組；12 h 觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換為完全培養(yǎng)基；感染72 h 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞感染效果，確認(rèn)感染條件和感染參數(shù)；后將成功感染的im PSCs轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2條件下，用含 2 μg/mL嘌呤霉素的無(wú)血清培養(yǎng)基連續(xù)篩選14 d；后用含1 μg/mL 嘌呤霉素完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞SV40LT 和hTERT 的RNA 表達(dá)水平驗(yàn)證

利用 TRIzol Reagent（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）從穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞（imPSCs）中提取RNA，然后使用PrimeScriptTMRT（TakaRa，大連，中國(guó)）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。使用 SYBR?PremixEx TaqTM II（Taka-Ra，大連，中國(guó)）的試劑盒，在 LightCycler?96SW 1.1 qRT-PCR 系統(tǒng)（Roche，Basel，Switzerland）上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃2 min 預(yù)變性，然后按 95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40 個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃ 7 min 延伸。用 GAPDH 作為內(nèi)參。結(jié)果通過(guò)2-△△CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量。SV40LT 和hTERT 引物合成于廣州睿博興科生物公司。

1.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞SV40LT 和hTERT 的蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞（imPSC），預(yù)冷 PBS 清洗 2 次，用含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞并測(cè)定蛋白濃度。取等量總蛋白于10%SDSPAGE 膠電泳。然后將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜中，恒流（250 mA）轉(zhuǎn)膜150 min；取出PVDF 膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，加入一抗（SV40LT 和hTERT購(gòu)買自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，1∶1000稀釋），4 ℃過(guò)夜，TBST 洗膜；二抗37 ℃搖床孵育1 h，TBST 洗膜。ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影曝光。

1.5 免疫熒光驗(yàn)證SV40LT 和hTERT 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系生物學(xué)表型情況

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞（imPSCs）消化種板，貼壁后棄上清，PBS 輕洗，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS 輕洗；0.2%Triton X-100/PBS 室溫透化 10 min；PBS 輕洗，1% BSA/PBS 室溫低速搖床封閉30 min；去除封閉液，孵育一抗（α-SMA、Collagen I、Fibronectin 抗體購(gòu)買自美國(guó)Abcam 公司，1∶200 稀釋），4 ℃過(guò)夜；棄去抗體，PBS 輕洗，孵育熒光二抗（美國(guó)Abcam公司），室溫低速搖床孵育30 min；去除抗體，PBS輕洗，DAPI 工作液染核5 min，PBS 輕洗，加入PBS，至于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.6 核型分析驗(yàn)證SV40LT 和hTERT 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系生物學(xué)表型情況

將imPSCs 細(xì)胞消化種板，貼壁后；將秋水仙素（終濃度0.2 μg/mL）加入培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；胰酶消化后收集細(xì)胞，1000 r/min 離心10 min，棄上清。加入0.5 mL 37 ℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCL混勻，緩慢補(bǔ)充至10 mL，混勻37 ℃孵育20～30 min；管中加入1 mL 新鮮固定液，室溫固定5 min，1000 r/min離心10 min，棄上清。緩慢加入新鮮固定液1 mL，室溫固定30 min，吹打均勻，1000 r/min離心10 min，棄上清。取0 ℃冰凍的載玻片，距玻片15 cm高度，向玻片滴加1～2 滴細(xì)胞懸液，室溫干燥。Giemsa染色10～20 min，流水沖洗玻片背面，晾干。二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，油鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)50 個(gè)處于分裂相的染色體，選取10 個(gè)分散好的G 顯代標(biāo)本進(jìn)行染色體核型分析。

1.7 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線驗(yàn)證SV40LT 和hTERT 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系生物學(xué)表型情況

將im PSCs 細(xì)胞消化后種于96 孔板，細(xì)胞1×104/mL，100 μL/孔鋪板，3 個(gè)復(fù)孔；采用 CCK8 法，連續(xù) 10 天，每 24 h 測(cè) 450 nm 處 OD 值，以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸做曲線即為生長(zhǎng)曲線。

1.8 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察SV40LT 和hTERT 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力

取 6～8 周齡，雌性 Balb/c-nu 裸小鼠 6 只，16～18 g 環(huán)境適應(yīng)7 天后，裸鼠被隨機(jī)分配至兩組，進(jìn)行細(xì)胞注射，觀察細(xì)胞成瘤能力。其中陽(yáng)性對(duì)照組：人胰腺細(xì)胞癌Panca-1；實(shí)驗(yàn)組：imPSCs（n=3）。5×106細(xì)胞重懸于0.1 mL PBS，注射于裸鼠左協(xié)腹部；后每周觀察小鼠精神、飲食及排便情況，稱重小鼠體重，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的長(zhǎng)度和寬度。觀察8 周后終止實(shí)驗(yàn)，斷髓處死小鼠取瘤塊稱重。摘取瘤體固定于4%甲醛用于組織學(xué)研究。

1.9 SV40LT 和hTERT 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系促胰腺癌細(xì)胞增殖遷移侵襲能力的情況

將 imPSCs 和原代 hPSCs 利用 Transwell 小室與胰腺癌Panc-1 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）共培養(yǎng)，將imPSCs 和原代hPSCs 分別種植在上室，Panc-1 在下室，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h；后將Panc-1 細(xì)胞胰酶消化后，分別種板；采用CCK8法檢測(cè)Panc-1 細(xì)胞增殖能力改變、Transwell 小室檢測(cè)Panc-1 細(xì)胞遷移侵襲能力改變，未共培養(yǎng)的Panc-1 細(xì)胞做對(duì)照。

1.9.1 CCK8法檢測(cè)Panc-1細(xì)胞增殖能力改變 將共培養(yǎng)后Panc-1 細(xì)胞消化后種于96 孔板，細(xì)胞1×104/mL，100 μL/孔鋪板，3 個(gè)復(fù)孔；采用 CCK8 法，連續(xù) 7 天，每 24 h 測(cè) 450 nm 處 OD 值，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況。

1.9.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Panc-1 細(xì)胞增殖能力改變將6孔板接種細(xì)胞前先用marker筆在孔板背面畫(huà)橫線標(biāo)記；共培養(yǎng)后Panc-1細(xì)胞消化后3×105/孔接種，細(xì)胞鋪滿板底后，用1 mL 槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，吸去培養(yǎng)液，PBS 沖洗三次，洗去細(xì)胞碎片。加入無(wú)血清培養(yǎng)基，12 h、24 h取出拍照記錄。

1.9.3 Transwell 小室檢測(cè)Panc-1 細(xì)胞遷移侵襲能力改變 侵襲試驗(yàn)前，Transwell 上室鋪250 μg/mL Matrigel 膠，37 ℃4 h，遷移試驗(yàn)無(wú)需鋪膠。共培養(yǎng)的和對(duì)照Panc-1 細(xì)胞按1×104/孔接種在上室，下室加入500 μL 含10% FBS 的完全培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)20 h（遷移試驗(yàn)）或40 h（侵襲試驗(yàn)）。純甲醛室溫下固定細(xì)胞15 min，PBS 洗2 次，室溫風(fēng)干5 min；Wright-Giemsa 應(yīng)用染色液染色30 min，雙蒸水洗3 次，室溫風(fēng)干；顯微鏡下觀察，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± SD）表示，兩組間定量資料比較，符合正態(tài)分布者采用t檢驗(yàn)和方差分析，不符合者采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定高表達(dá)SV40LT 基因和hTERT 基因hPSCs 細(xì)胞系的建立

通過(guò)outgrowth 方法提取的原代hPSCs，貼壁良好，呈多角形和梭形（圖1A）；傳至第3 代時(shí)，將SV40LT 重組慢病毒和hTERT 重組慢病毒轉(zhuǎn)染hPSCs 細(xì)胞中，以獲得穩(wěn)定高表達(dá)兩個(gè)基因的hPSCs細(xì)胞株（稱為im PSCs），陰性對(duì)照病毒為對(duì)照細(xì)胞株（nc PSCs）。由于慢病毒載體自帶GFP熒光蛋白，顯微鏡下可看到imPSCs 呈梭形、帶有綠色熒光，而hPSCs 和ncPSCs 則不帶有綠色英光，提示imPSCs成功感染慢病毒（圖1A）；且三組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)基本一致，提示病毒感染對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)未產(chǎn)生明顯影響。病毒感染72 h 后，熒光顯微鏡確定成功轉(zhuǎn)染后，用嘌呤霉素連續(xù)篩選14 d，后常規(guī)傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行qRT-PCR 和Western blot檢測(cè)兩個(gè)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，imPSCs 細(xì)胞 SV40LT 和 hTERT 基因在mRNA（圖1B）和蛋白（圖1C）水平表達(dá)量均顯著升高，提示慢病毒感染成功。

2.2 免疫熒光方法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系im PSCs 生物學(xué)表型情況

圖1 永生化PSCs（imPSCs）驗(yàn)證 A：胰腺星狀細(xì)胞呈梭形和多角形，永生化imPSCs 顯微鏡下呈星芒狀綠色熒光，證實(shí)慢病毒轉(zhuǎn)染成功；B：qRT-PCR 方法驗(yàn)證hTERT 和SV40 基因高表達(dá)；C：Western blot 方法驗(yàn)證hTERT 和SV40 基因高表達(dá)

經(jīng)過(guò)嘌呤霉素連續(xù)篩選的穩(wěn)定高表達(dá)SV40LT和 hTERT 的 imPSCs，具有活化 PSCs 的功能，可表達(dá)α-SMA、Collagen I、Fibronectin 蛋白。如圖 2 所以，免疫熒光方法檢測(cè)imPSCs 呈典型的活化狀態(tài)，高表達(dá)α-SMA、Collagen I、Fibronectin 蛋白。

圖2 細(xì)胞免疫熒光imPSCs 表達(dá)α-SMA、Collagen I、Fibronectin 蛋白（藍(lán)色細(xì)胞核，紅色目的蛋白）

2.3 im PSCs 染色體核型分析及生長(zhǎng)曲線

觀察第15 代im PSCs 細(xì)胞染色體核型分析可見(jiàn)，im PSCs 染色體總數(shù)增多，提示細(xì)胞處于分裂相（圖3A）。將imPSCs 和ncPSCs 消化后種板，采用CCK8 法連續(xù)10 天檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，imPSCs 細(xì)胞呈典型的“S”型（圖3B），增殖能力較對(duì)照組明顯增加，且形態(tài)未發(fā)生改變。這些結(jié)果提示imPSCs有不斷增殖分裂的能力，具有永生化的潛能。

圖3 imPSCs 表型情況 A：染色體核型分析證實(shí)永生化imPSCs 染色體數(shù)目增多；B：生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”型；C：體內(nèi)證實(shí)imPSCs不具有成瘤能力，無(wú)惡性表型轉(zhuǎn)化（紅色箭頭接種部位）

2.4 細(xì)胞成瘤實(shí)驗(yàn)

取imPSCs 細(xì)胞及胰腺癌Panc-1 細(xì)胞，分別接種于裸鼠背部，連續(xù)培養(yǎng)2 月，觀察到imPSCs 組未形成瘤塊（圖3C）；而Panc-1 組在接種2 周后可觀察到腫瘤形成，并逐漸增大。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，取出腫瘤組織行HE 染色，顯示細(xì)胞核排列雜亂、大小不一的特點(diǎn)（圖3C）。該結(jié)果說(shuō)明成瘤實(shí)驗(yàn)操作無(wú)誤，imPSCs 在裸鼠內(nèi)無(wú)成瘤性，無(wú)惡性轉(zhuǎn)化。

圖4 imPSCs 促胰腺癌細(xì)胞增殖能力驗(yàn)證 A：imPSCs 和hPSCs 與胰腺癌Panc-1 共培養(yǎng)后，胰腺癌Panc-1 細(xì)胞增殖速度增快；B：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)imPSCs 的促癌作用

2.5 檢測(cè)imPSCs 和人原代hPSC 同樣的促胰腺癌細(xì)胞增殖能力

將人原代hPSCs 和imPSCs 分別與胰腺癌Panc-1 細(xì)胞共培養(yǎng)，48 h 后消化Panc-1 細(xì)胞分別行CCK8、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和遷移侵襲實(shí)驗(yàn)，未共培養(yǎng)Panca-1 做對(duì)照，結(jié)果顯示和 hPSCs 和 imPSCs 共培養(yǎng)的Panc-1 細(xì)胞增長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組，hPSCs和imPSCs 兩組之間沒(méi)有明顯差異（圖4A）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦提示永生化細(xì)胞系具有促imPSCs 增殖能力（圖4B）；遷移侵襲實(shí)驗(yàn)顯示同樣的結(jié)果，hPSCs 和imPSCs 組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（P＜0.05），但 hPSCs 和 imPSCs 兩組之間沒(méi)有差異（圖5）。

3 討 論

圖5 imPSCs 促胰腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力驗(yàn)證：imPSCs 和hPSCs 與胰腺癌Panc-1 共培養(yǎng)后，與未共培養(yǎng)Panc-1 細(xì)胞相比，遷移侵襲能力增加（*P＜0.05 vs.Control）；imPSCs 和hPSCs 對(duì)比無(wú)差異

胰腺癌癥狀隱匿，早期診斷率低且惡性程度高，大部分患者確診時(shí)已是晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，化療是主要治療方法；即使使用一線化療藥物吉西他濱，5 年生存率仍低于 5%［1，2］。間質(zhì)纖維化使化療藥物難以滲透入腫瘤組織內(nèi)部，這是導(dǎo)致胰腺癌患者化療效果差的重要原因之一［23］，針對(duì)腫瘤間質(zhì)進(jìn)行干預(yù)以提高抗腫瘤效果是胰腺癌研究的熱點(diǎn)和新方向［24］。PSCs 是胰腺癌間質(zhì)成分的主要來(lái)源，是腫瘤間質(zhì)主要的研究靶點(diǎn)；但其沒(méi)有可供使用的細(xì)胞株，使用鼠源或人原代培養(yǎng)純化的hPSCs，持續(xù)分裂能力有限，且來(lái)源于不同組織標(biāo)本原代分離的細(xì)胞會(huì)受標(biāo)本來(lái)源的性別、年齡、遺傳背景等方面的影響，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性較差。鑒于此，構(gòu)建永生化PSCs 細(xì)胞系對(duì)于進(jìn)行PSCs 及其與胰腺癌細(xì)胞之間的研究非常必要。

研究發(fā)現(xiàn)，SV40LT 抗原可通過(guò)與抑癌基因Rb及P53 相互作用發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和永生化的功能［25-27］，重組慢病毒 hTERT 基因?qū)爰?xì)胞后可通過(guò)重建端粒酶活性的方法使細(xì)胞具有永生化功能。在此研究基礎(chǔ)上，我們擬聯(lián)合使用SV40LT 基因和hTERT 基因構(gòu)建永生化PSCs 細(xì)胞系并驗(yàn)證其功能，將其運(yùn)用到后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中。

我們收集胰腺癌患者外科手術(shù)組織標(biāo)本，采用outgrowth 方法提取并純化原代PSCs，顯微鏡下觀察到呈多角形和梭形的細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)良好；然后采用慢病毒感染方法將SV40LT 抗原基因和hTERT 基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，采用嘌呤霉素篩選。由于慢病毒帶有GFP 質(zhì)粒，自帶綠色熒光，成功感染病毒的hPSCs在顯微鏡下會(huì)發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。確定成功感染病毒后進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR 和Western blot 方法驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)SV40T 和hTERT 基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在mRNA 和蛋白水平，這兩個(gè)基因均高表達(dá)，提示病毒感染后這兩個(gè)基因成功轉(zhuǎn)入hPSCs 發(fā)揮作用。為進(jìn)一步明確成功導(dǎo)入兩個(gè)基因的imPSCs 是否具有永生化的功能及保持PSCs活化的表型，采用CCK8 法觀察imPSCs 生長(zhǎng)狀態(tài)，生長(zhǎng)曲線顯示其呈典型的“S”型生長(zhǎng)趨勢(shì)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；核型分析顯示imPSCs 細(xì)胞染色體總數(shù)增多，大部分細(xì)胞處于細(xì)胞分裂狀態(tài)；這些結(jié)果均提示imPSCs 細(xì)胞呈現(xiàn)良好的分裂能力，具備持續(xù)分裂潛能。為驗(yàn)證永生化imPSCs 是否具備活化PSCs 的表型，我們采用免疫熒光方法驗(yàn)證其活化標(biāo)記物α-SMA 和基質(zhì)蛋白Collagen I、Fibronectin 表達(dá)情況，結(jié)果顯示 imPSCs高表達(dá)α-SMA、Collagen I、Fibronectin 蛋白，保持為PSCs 的活化狀態(tài)。imPSCs 細(xì)胞染色體總數(shù)發(fā)生改變，為驗(yàn)證其是否發(fā)生惡性表型轉(zhuǎn)化，采用裸鼠皮下成瘤的方法驗(yàn)證，接種8 周后imPSCs 組未出現(xiàn)皮下腫瘤組織，而對(duì)照胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1 組長(zhǎng)出腫瘤組織。以上這些結(jié)果表明，永生化imPSCs 不僅保持了PSCs 的形態(tài)和活化狀態(tài)，還具備了持續(xù)分化的潛能、未發(fā)生惡性表型轉(zhuǎn)化，細(xì)胞系構(gòu)建成功，可用于相關(guān)研究。

PSCs 活化后，可分泌多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子與胰腺癌細(xì)胞相互作用，促腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲等能力明顯增強(qiáng)［5，6］。為進(jìn)一步驗(yàn)證 imPSCs 的促瘤作用，我們將imPSCs 和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，未共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞作陰性對(duì)照，與人原代hPSCs 共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞做陽(yáng)性對(duì)照。采用CCK8 法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞增殖情況、遷移侵襲實(shí)驗(yàn)觀察腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力；結(jié)果表明，共培養(yǎng)的兩組腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移侵襲能力較未共培養(yǎng)組明顯增強(qiáng)，且imPSCs 和人原代hPSCs 促腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移侵襲能力相當(dāng)。這些結(jié)果說(shuō)明imPSCs 還保持了人原代PSCs 的促腫瘤作用，可以運(yùn)用于與胰腺癌腫瘤細(xì)胞相關(guān)關(guān)系研究。

綜上所述，本研究利用胰腺癌組織標(biāo)本獲得原代PSCs，并采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法，導(dǎo)入SV40LT 和hTERT基因，構(gòu)建一株穩(wěn)定高表達(dá)兩個(gè)基因的人胰腺星形細(xì)胞系imPSCs，并采用多種方法驗(yàn)證imPSCs不但具有人胰腺星型細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能，且未發(fā)生惡性表型轉(zhuǎn)化，為胰腺星形細(xì)胞自身功能和其與胰腺癌細(xì)胞相互作用關(guān)系、胰腺癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)研究提供了可靠、理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>