艾永飛,劉 靜,蘇菲菲,楊競霄,尚福軍

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:434979751@qq.com)

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病之一,2019年國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)(http://www.diabetesatlas.org/)最新數(shù)據(jù)顯示,2019年全球約有4.63億糖尿病患者,預(yù)計到2045年全球?qū)⒂?億糖尿病患者。由于糖尿病是心血管疾病的重要危險因素之一[1],糖尿病引起的心血管疾病發(fā)病率和死亡率的增加已經(jīng)成為全球健康防治領(lǐng)域的重要難題。糖尿病所造成的心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變主要表現(xiàn)為心肌肥厚、心肌舒張功能不全、心肌間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡[1],但其具體發(fā)生機(jī)制尚不明確,并缺少有效的防治措施。研究表明,高血糖能夠直接引起心肌細(xì)胞損傷和凋亡[2],而心肌細(xì)胞作為終末端分化細(xì)胞,其再生與增殖極弱,因此心肌細(xì)胞的損傷與凋亡被認(rèn)為是高血糖引發(fā)心血管疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵原因。

褪黑素是由哺乳動物松果體分泌在全身多個臟器均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的一種胺類激素,其分泌具有晝夜節(jié)律性,夜間合成較多,白天分泌較少[3]。研究顯示,褪黑素在心血管領(lǐng)域具有減輕心肌缺血損傷和心肌肥厚,防治心衰等疾病的作用。最新研究也顯示:褪黑素能夠改善睡眠,治療2型糖尿病[3,4]。然而,褪黑素在糖尿病心肌病中的生物學(xué)作用及其機(jī)制尚未明確,本研究擬從細(xì)胞水平探討褪黑素在高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞損傷的作用以及機(jī)制,為糖尿病心肌病的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

C57BL/6乳鼠,出生1-3 d,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心;褪黑素、膠原酶Ⅱ購自美國Sigma公司、沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin1,SIRT1)、Beclin1和自噬相關(guān)5同源物(autophagy related 5 homolog,Atg5)購自美國CST公司;cleaved Caspase-3、Bcl-2-associated X的蛋白質(zhì)(Bcl-2-associated X,Bax)和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)購于美國Abcam公司;GAPDH購自美國Santa Cruz公司,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA強(qiáng)裂解液及5×loadding buffer購自上海碧云天生物有限公司;PVDF膜及ECL發(fā)光液購于美國Millipore公司;EX527購自美國Selleck Chemicals公司;First Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ購自日本Takara公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司;高糖DMEM、低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 取新生3 d內(nèi)的C57BL/6小鼠,3%異氟烷深度麻醉后,脫頸處死。750 ml/L乙醇消毒,打開胸腔,摘取心臟,去心房,并用預(yù)冷的DPBS漂洗3次。將心室肌剪為<1 mm3的組織塊,靜置吸棄DPBS,加入5 ml的0.5 mg/ml的膠原酶Ⅱ,37 ℃振搖消化20 min;加入含有10% FBS的培養(yǎng)基終止消化,吸取上層混懸液,下層組織再次加入消化液進(jìn)行消化,直至組織塊完全消化。將收集的上層混懸液經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾,收集濾液至離心管,800 r/min離心5 min,收集細(xì)胞,然后加入含有10%FBS的培養(yǎng)基,按照5×105個/皿的細(xì)胞密度進(jìn)行接種,然后在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。為了檢測高糖對心肌細(xì)胞的損傷,我們將原代心肌細(xì)胞分別用5.5,11,22,33 mmol/L D-葡萄糖刺激處理時間為24 h。

為了闡明褪黑素上調(diào)SIRT1改善高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞損傷的作用機(jī)制,我們將原代心肌細(xì)胞分為對照組(Con組)、褪黑素對照組(Con+Mel組)、高糖對照組(HG組)、高糖+褪黑素組(HG+Mel組)、SIRT1抑制劑組(HG+Mel+EX527組)。Con組為5.5 mmol/L D-葡萄糖處理24 h;褪黑素對照組(Con+Mel組):在添加5.5 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)基同時添加褪黑素,使其終濃度為100 μmol/L;高糖對照組(HG組):33 mmol/L D-葡萄糖;高糖+褪黑素組(HG+Mel組):在添加33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基同時添加褪黑素,使褪黑素終濃度為100 μmol/L,處理24 h。SIRT1抑制劑組(HG+Mel+EX527組):在添加33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基同時添加褪黑素和EX527,使褪黑素終濃度為100 μmol/L,EX527終濃度為10 μmol/L,處理24 h。

1.2.2 CCK-8檢測原代心肌細(xì)胞活力 按照每孔接種約4×103個細(xì)胞將原代乳鼠心肌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)皿中,然后按照方法1.2.1中分組進(jìn)行干預(yù)處理24 h,干預(yù)結(jié)束后棄掉培養(yǎng)基,PBS洗滌,然后加入200 μl高糖DMEM培養(yǎng)基(無血清)和20 μl CCK-8溶液于96孔板中,在37 ℃,50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min,然后使用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm處的吸光度值。

1.2.3 SOD和MDA檢測 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平通過細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD含量進(jìn)行評價,具體實(shí)驗(yàn)方法參照MDA和SOD試劑盒說明書進(jìn)行,MDA于532 nm處測定吸光度值,SOD于波長450 nm處測定吸光度值。

1.2.4 實(shí)時定量RT-PCR檢測SIRT1基因表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)說明書步驟,以20 μl體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RCR,合成cDNA。引物序列見表1。之后參照定量檢測試劑盒(SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ)進(jìn)行反應(yīng),使用GAPDH作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.5 免疫印跡(Western blot)檢測SIRT、Beclin1、Atg5、Bax和Bcl-2表達(dá) 按照方法1.2.1中分組在各組細(xì)胞干預(yù)處理結(jié)束后,將其置于冰上,PBS漂洗多次,強(qiáng)RIPA裂解液(100 μl/106細(xì)胞)裂解20 min,細(xì)胞刮輕輕將刮取細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,收集上清。上清液取出10 μl進(jìn)行BCA蛋白定量,具體方法參照CA蛋白定量試劑盒說明書。剩余上清液加入1/4體積的5×loading buffer,沸水浴10 min,然后放置室溫5 min,之后將其放入-80 ℃保存。SDS-PEGE配置電泳用于蛋白的分離,上樣量50 μg/孔道,120 V,90 min電泳。300 mA,180 min轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉(50 g/L)室溫封閉2 h,然后在4℃下進(jìn)行一抗(SIRT、Beclin1、Atg5、Bax和Bcl-2稀釋比1 ∶1 000)孵育,過夜。然后TBST漂洗,加入二抗(1 ∶6 000),室溫孵育2 h,TBST漂洗,進(jìn)行ECL發(fā)光。

1.2.6 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 按照方法1.2.1中分組原代心肌細(xì)胞干預(yù)處理24 h后,棄掉原細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS多次漂洗,20 μg/μl的蛋白酶K室溫孵育20 min,然后進(jìn)行TUNEL染色,倒置熒光顯微鏡采集圖像,Image plus軟件進(jìn)行圖像分析。其中染色具體步驟參照據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對高糖所致原代心肌細(xì)胞活力下降和細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用

CCK-8細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示:22,33 mmol/L D-葡萄糖刺激24 h后均造成原代乳鼠心肌細(xì)胞活力減低,且隨D-葡萄糖濃度的增加,細(xì)胞相對活性下降程度遞增(見圖1)。與5.5 mmol/L D-葡萄糖相比,33 mmol/L D-葡萄糖造成細(xì)胞相對活性降低30%以上,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),因此在后續(xù)我們選擇33 mmol/L D-葡萄糖為高糖組模型建立的實(shí)驗(yàn)濃度。給予褪黑素干預(yù)后,HG+Mel組原代心肌細(xì)胞活力較HG組上升(P<0.05),但Con+Mel組細(xì)胞活力與Con組相比無顯著性差異(P>0.05,見圖1)。

與5.5mmol/L D-葡萄糖相比,*P<0.05;與11 mmol/L D-葡萄糖組相比,△P<0.05;與22 mmol/L D-葡萄糖組相比,&P<0.05;與Con組相比,▲P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖1 褪黑素對高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞活力的影響 (n=6)Figure 1 Effects of melatonin on cell viability of primary cardiomyocytes exposed to HG (n=6)

2.2 褪黑素減輕高糖引起的原代心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡

與Con組相比,HG組原代心肌細(xì)胞MDA水平增加(P<0.05),而抗氧化物SOD活性下降(P<0.05)。給予褪黑素干預(yù)后,與HG組相比,HG+Mel組MDA水平降低,SOD活性增加(P<0.05);但與Con組相比,Con+Mel組MDA水平和SOD無差異(見圖2)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖2 褪黑素對高糖引起的原代心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 (n=6)Figure 2 Effect of melatonin on oxidative stress of primary cardiomyocytes induced by high glucose (n=6)

2.3 褪黑素減輕高糖引起的原代心肌細(xì)胞凋亡

蛋白免疫跡實(shí)驗(yàn)顯示:相比于Con組,HG組心肌細(xì)胞凋亡蛋白cleaved Caspase-3和Bax升高,抗凋亡蛋白Bcl-2下降(均P<0.05)。但相比于HG組,HG+Mel組凋亡蛋白cleaved Caspase-3和Bax的表達(dá)量降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量上升(均P<0.05);同時結(jié)果也顯示:相比于Con組,Con+Mel組cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)無顯著差異,但Bcl-2表達(dá)量增加(見圖3)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖3 Western blotting檢測褪黑素對高糖引起的原代心肌細(xì)胞凋亡蛋白的影響 (n=6)Figure 3 Effect of melatonin on apoptosis-related proteins in high glucose-induced primary cardiomyocytes by Western blotting (n=6)

2.4 褪黑素對高糖導(dǎo)致的原代心肌細(xì)胞自噬活動抑制的影響

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HG組原代心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1,Atg5表達(dá)較Con組降低(P<0.05)。褪黑素干預(yù)后,HG+Mel組Beclin1、Atg5表達(dá)量高于HG組(P<0.05)。而且,值得注意的是Con+Mel組Beclin1,Atg5表達(dá)量也較Con組增加(P<0.05,見圖4)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖4 Western blotting檢測褪黑素對高糖引起的心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (n=6)Figure 4 Effect of melatonin on the autophagy-related protein expression in primary cardiomyocytes under HG conditions by Western blotting (n=6)

2.5 褪黑素在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提高新生乳鼠心肌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)

實(shí)時定量RT-PCR結(jié)果顯示:相比于Con組,HG組心肌細(xì)胞SIRT1 mRNA水平下調(diào)(P<0.05);給以褪黑素處理后,Con+Mel組SIRT1表達(dá)相比于Con組增加,HG+Mel組SIRT1表達(dá)也相比于HG組增加(P<0.05)。SIRT1蛋白水平表達(dá)顯示出同基因水平相似的結(jié)果,相比于Con組,HG組SIRT1蛋白表達(dá)降低。給予褪黑素處理后,Con+Mel組SIRT1蛋白表達(dá)相比于Con組上升。HG+Mel組SIRT1蛋白表達(dá)相比于HG組增加(P<0.05,見圖5)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05圖5 實(shí)時定量RT-PCR和Western blot檢測褪黑素對原代心肌細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響 (n=6)Figure 5 Effect of melatonin on Sirt1 mRNA and protein expression in primary cardiomyocytes by RT-PCR and Western blot (n=6)

2.6 褪黑素對心肌細(xì)胞自噬的影響與SIRT1有關(guān)

本實(shí)驗(yàn)通過添加SIRT1的特異性小分子抑制劑EX527干預(yù)SIRT1,來研究褪黑素與SIRT1關(guān)系。與前面結(jié)果一致,與Con組相比,HG組自噬相關(guān)蛋白Beclin1和Atg5表達(dá)降低(P<0.05)。但褪黑素干預(yù)后,HG+Mel組Beclin1和Atg5表達(dá)較HG組增加(P<0.05)。添加EX527特異性抑制SIRT1活性后,HG+Mel+EX527組Beclin1、Atg5表達(dá)量相比于HG+Mel組減少(P<0.05,見圖6)。

與HG組相比,#P<0.05;與HG+Mel組相比,*P<0.05圖6 褪黑素通過SIRT1上調(diào)原代心肌細(xì)胞自噬 (n=5)Figure 6 Melatonin increased autophagic activities in primary cardiomyocytes under HG conditions by SIRT1 pathway (n=5)

2.7 褪黑素通過SIRT1途徑減輕高糖引起的原代心肌細(xì)胞凋亡

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示:相對于HG+Mel組,添加EX527特異性抑制SIRT1活性后,HG+Mel+EX527組cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)量增高(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降(P<0.05,見圖7)。

與HG組相比,#P<0.05;與HG+Mel組相比,*P<0.05圖7 蛋白免疫印跡檢測心肌細(xì)胞凋亡 (n=5)Figure 7 Apoptosis level in primary cardiomyocytes detected by western blot (n=5)

除此之外,我們通過TUNEL染色檢測細(xì)胞的凋亡比率,結(jié)果顯示,HG組原代心肌細(xì)胞凋亡比例高于Con組(P<0.05);給予褪黑素預(yù)處理后,HG+Mel組原代心肌細(xì)胞凋亡比例低于HG組(P<0.05);Con+Mel組原代心肌細(xì)胞凋亡與Con組相比無差異(P>0.05);添加EX527特異性抑制SIRT1活性后,HG+Mel+EX527組原代心肌細(xì)胞凋亡比例高于HG+Mel組(P<0.05,見圖8)。

與Con組相比,*P<0.05;與HG組相比,#P<0.05;與HG+Mel組相比,△P<0.05圖8 TUNEL染色檢測原代心肌細(xì)胞凋亡 (×20)Figure 8 The apoptosis level in primary cardiomyocytes by TUNEL staining (×20)

3 討論

糖尿病是排除年齡、高血壓、肥胖和冠心病后的心血管疾病的獨(dú)立危險因素,它能夠造成心臟結(jié)構(gòu)上的改變,如心肌肥大、纖維化、細(xì)胞壞死和凋亡等,進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能減退,最終導(dǎo)致心力衰竭[5]。盡管目前對于糖尿病引發(fā)的心血管疾病發(fā)生的機(jī)制尚不明確,但是高糖直接誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的損傷和凋亡被認(rèn)為是糖尿病引發(fā)心血管疾病發(fā)生病理改變的關(guān)鍵因素。因此,深入研究高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡的發(fā)生機(jī)制及其防治措施對糖尿病心血管疾病的防治具有重要意義。

研究表明,高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡增多可能與氧化應(yīng)激的失調(diào)密切有關(guān)[6]。在正常生理情況下,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧可被SOD抗氧化物有效清除,但在病理條件下抗氧化物活性減低,活性氧難以被消除,活性氧在細(xì)胞累積過多,進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)容物被氧化,細(xì)胞凋亡發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報道一致[7],高糖導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧生成增多和清除能力的下降,細(xì)胞凋亡增加,具體表現(xiàn):HG組較Con組心肌細(xì)胞MDA表達(dá)增高,SOD活性下降,心肌細(xì)胞凋亡比率上升、凋亡蛋白cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)上升,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降(P<0.05)。褪黑素作為一種胺類激素,具有高度的親脂性,可以通過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入幾乎全身各個組織細(xì)胞發(fā)揮抗炎和抗氧化應(yīng)激等作用[3,4]。但褪黑素是否能夠抑制高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制如何,是否與抗氧化應(yīng)激相關(guān)暫不清楚。我們的研究從細(xì)胞水平探討褪黑素在高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞損傷和凋亡的作用和相關(guān)機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn),添加褪黑素可抑制高糖引起的MDA生成,并增加抗氧化物SOD活性,抑制高糖引起原代心肌細(xì)胞凋亡,抑制cleaved Caspase-3和Bax表達(dá)上調(diào),促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。而且有趣的是,我們結(jié)果也顯示添加褪黑素不會引起正常對照組細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和凋亡水平的增加,但卻促進(jìn)了正常對照組細(xì)胞抗氧化物SOD活性的提高,增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。以上結(jié)果提示:褪黑素可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激而發(fā)揮抗高糖毒性的心肌保護(hù)作用。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin1,SIRT1)是一種NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶,它通過對包括組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的多種蛋白去乙?；?進(jìn)而在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、衰老、凋亡、應(yīng)激應(yīng)答以及衰老等方面發(fā)揮重要作用[8]。SIRT1由催化區(qū)域和催化區(qū)域外的N端區(qū)域和C端區(qū)域兩個部分,共747個氨基酸組成。目前,研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在包括大腦、心臟、肝臟、胰腺、骨骼肌、脾臟及脂肪組織等多個身體器官廣泛表達(dá),參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、染色質(zhì)修飾、能量代謝和炎癥反應(yīng)等過程[9]。在心血管系統(tǒng)中,大量研究表明SIRT1活性增加可以抵御心肌細(xì)胞的損傷,發(fā)揮抗動脈粥樣硬化、抗心肌衰老、減輕心肌肥大與纖維化、改善缺血再灌注損傷等多種作用[10]。目前對于SIRT1作用機(jī)制盡管仍有爭議,但不容否認(rèn)的是多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)SIRT1是調(diào)控氧化應(yīng)激和凋亡的關(guān)鍵信號分子[9-11]。此外,在心肌缺血模型中,褪黑素被證實(shí)能夠通過激活SIRT1改善心肌缺血損傷[12]。但是褪黑素是否通過SIRT抑制高糖介導(dǎo)的心肌損傷,以及機(jī)制如何,尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn),高糖組原代心肌細(xì)胞SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)較對照組減低;而在存在或不存在高糖刺激的條件下,褪黑素均能增強(qiáng)SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá),降低氧化應(yīng)激水平,抑制原代心肌細(xì)胞凋亡,部分對抗高糖引起的細(xì)胞損害。而為了進(jìn)一步研究SIRT1在褪黑素對高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,我們用EX527,一種SIRT1的特異性抑制劑,去阻斷SIRT1信號,發(fā)現(xiàn)褪黑素拮抗高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡的作用被EX527剝奪,提示褪黑素的原代心肌細(xì)胞保護(hù)作用依賴于SIRT1的上調(diào)。

自噬是吞噬自身受損、變性和錯誤折疊等的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡,并通過與溶酶體形成自噬溶酶體,降解其內(nèi)容物的生理過程。自噬是細(xì)胞保持細(xì)胞器新陳代謝穩(wěn)態(tài),進(jìn)而進(jìn)一步保持細(xì)胞活性穩(wěn)定的必要過程.[13]。以往研究發(fā)現(xiàn),心臟中自噬維持是心臟正常運(yùn)作的必要條件,心臟條件性敲除自噬相關(guān)基因則會引起心臟功能障礙[14]。目前已有研究表明,SIRT1通路對衰老、凋亡、糖尿病心肌病、缺血再灌注損傷等的保護(hù)作用,可能均與細(xì)胞自噬的激活相關(guān)[15]。但褪黑素通過SIRT1激活抵抗高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡,是否與SIRT1對細(xì)胞自噬的調(diào)控相關(guān),仍不清楚。我們結(jié)果發(fā)現(xiàn),高糖刺激心肌細(xì)胞,自噬相關(guān)蛋白Beclin1,Atg5表達(dá)量降低;褪黑素干預(yù)則在存在和不存在高糖刺激的條件下,均能提高原代心肌細(xì)胞Beclin1、Atg5表達(dá)量。而給予SIRT1抑制劑EX527抑制SIRT1活性后,相比于HG+Mel組,HG+Mel+EX527組Beclin1和Atg5表達(dá)量減少,心肌細(xì)胞凋亡增加。以上提示褪黑素抑制高糖誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡作用與SIRT1對自噬的調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素抑制高糖誘導(dǎo)原代心肌細(xì)胞凋亡,其可能是通過激活SIRT1,增強(qiáng)細(xì)胞自噬,抑制氧化應(yīng)激,進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡發(fā)揮其心肌保護(hù)作用。