黃貽培 ，羅偉鑫 ，許磊波 *

肝細胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是肝臟最常見的原發(fā)惡性腫瘤，具有起病隱匿及容易復發(fā)轉(zhuǎn)移的特點，往往預后不良［1-3］。目前根治性手術(shù)及手術(shù)替代方案（如靶向治療）均有較大的缺陷和不確定性。弄清HCC 發(fā)生發(fā)展機制仍然是科研人員不斷追求的目標。Yin Yang 1（YY1）是一類含有C2H2 型鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于GL1-Kruppel 蛋白質(zhì)家族，通過不同的活性區(qū)域與靶基因啟動子結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，參與調(diào)控細胞干性、分化以及細胞復制、增殖等生物學過程［4-6］。近來的研究顯示，YY1 可通過抑制腫瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移或誘導腫瘤細胞凋亡，在乳腺癌、胰腺導管腺癌及食管鱗狀細胞癌起抑癌基因的作用［7-11］；與此相反，在肺癌、胃癌及結(jié)直腸癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中則發(fā)揮原癌基因的作用［11-13］，表明YY1 在腫瘤進展中功能的發(fā)揮具有背景依賴性。YY1 在肝癌中的作用尚存在爭議，Kim JS 等學者報道YY1 分布在肝癌細胞核及細胞漿中，細胞核中YY1 高表達的肝癌患者腫瘤分期更晚，且多合并血管侵犯，患者的生存預后更差，表明YY1在肝癌中發(fā)揮促癌作用［14］；而Wang LM 等的研究則顯示，YY1 在肝癌組織中低表達，并于體外實驗證實抑制YY1 表達后肝癌細胞凋亡減少、侵襲轉(zhuǎn)移能力顯著增強，表明YY1在肝癌的進展中發(fā)揮抑癌基因作用［15］。因此，YY1 在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用亟待更多臨床樣本驗證及深入的分子生物學機制研究。本研究通過公共數(shù)據(jù)庫及臨床組織樣本分析YY1 在肝癌中的預后意義，同時探討YY1 對肝癌細胞生物學行為的影響，觀察其對肝癌細胞體外增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 肝癌轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)

從腫瘤基因組圖譜計劃（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中查找并下載肝癌的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)TCGA-LIHC 及相關(guān)臨床參數(shù)進行分析，得到374 例肝癌及配對的50 例癌旁組織的mRNA表達數(shù)據(jù)。同時從美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）創(chuàng)建的基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）和國際癌癥基因組聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫（The International Cancer Genome Consortium，ICGC）中下載肝癌mRNA 片數(shù)據(jù)作為驗證隊列，獲取GSE14520、GSE25097 及LIRI-JP 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。其中GSE14520 有225 例肝癌及220 例配對癌旁組織的mRNA 表達數(shù)據(jù)；GSE25097 有 6 例正常肝組織，40 例肝硬化組織，268 例肝癌及243 例配對癌旁組織的 mRNA 表達數(shù)據(jù)；LIRI-JP 包括有 243 例肝癌及配對的202 例癌旁組織的mRNA 表達數(shù)據(jù)。

1.2 肝癌組織樣本

本研究經(jīng)中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準，并獲得受試者的知情同意。本研究采用自 2019 年 9 月～2019 年 12 月在中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院行手術(shù)切除治療的30 對肝癌組織及配對的正常肝組織標本，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定后用石蠟包埋長期保存，并制成4 μm 厚組織切片行免疫組化染色，所有患者術(shù)后病理學報告證實為肝細胞癌。

1.3 肝癌細胞系及細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞系 Huh7、PLC/PRF/5、HepG2 和Hep3B 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC），正常肝細胞系L02、肝癌細胞系 BEL-7402、MHCC97H、HCCLM3 均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，在含有10%胎牛血清（Gibco，USA）的DMEM（BI，Israel）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，常規(guī)添加100 μg/mL 鏈霉素及100 U/mL青霉素（BI，Israel），于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 實驗試劑

YY1 和GAPDH 兔抗人單克隆抗體分別購自美國 Abcam 和 Cell Signaling Technology 公司；免疫組化試劑盒（Dako，Denmark）；BCA 蛋白定量試劑盒（Invitrogen，USA）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TB Green染料法標準型定量試劑盒（Takara，Japan）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測試劑盒（Yeasen，China）；Edu 檢測試劑盒（Beyotime，China）8 μm 孔徑的 Transwell 小室及 Matrigel 購自美國 Corning 公司 ；YY1 及 GAPDH 引 物 序 列 為 ：GAPDH-F：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT；GAPDH-R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG；YY1-F：AAGAGCGGCAAGAAGAGTTAC；YY1-R：CAACCACTGTCTCATGGTCAATA。

1.5 免疫組化

肝癌組織石蠟切片經(jīng)60℃烘烤2 h，趁熱置于二甲苯中10 min 進行脫蠟處理，使用不同濃度梯度的酒精（無水酒精，95%，80%，75%）行水化處理，經(jīng)0.3%的過氧化氫處理10 min 去除內(nèi)源性過氧化氫酶后，使用Tris-HCl（pH=9.2）抗原修復液于高壓鍋中修復10 min，YY1 抗體按1∶1 000 濃度4℃于濕盒孵育過夜。次日PBS 洗去一抗，37℃溫箱孵育二抗30 min，DAB（DAKO，Denmark）顯色后用蘇木素進行細胞核染色。根據(jù)染色強度，將YY1組織染色強度評分分為：0=無染色，1=染色弱，2=染色中等，3=染色強，染色范圍按百分比計算（0～100）。強度評分乘以染色范圍即為YY1 的染色評分。

1.6 蛋白免疫印跡實驗

處于對數(shù)生長期的細胞用預冷的PBS 洗去培養(yǎng)基，甩干后加入預先配好的細胞裂解液（RIPA裂解液+1∶100 蛋白酶抑制劑+1∶100 磷酸酶抑制劑，均購自中國康為世紀公司），冰上裂解15 min，15 000 rpm 離心20 min 后取上清經(jīng)BCA 法測定蛋白濃度。按細胞總蛋白量20 μg 進行上樣，經(jīng)10%的SDS-PAGE 進行蛋白電泳，然后經(jīng)電轉(zhuǎn)至PVDF膜（Millipore，USA）上。加入一抗（YY1 與GAPDH均按照1∶1000 稀釋使用）后置于4℃冰箱過夜孵育，次日TBST 洗去一抗后，抗兔二抗（Cell Signaling Technology，USA）室溫孵育1 h。BCL 超敏發(fā)光液（Millipore，USA）曝光并拍攝。

1.7 實時熒光定量PCR

按照試劑說明書使用RNAiso Plus（Invitrogen，USA）提取細胞RNA，采用PrimerScript RT Master Mix 試劑盒（Takara，Japan）進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。實時定量PCR 實驗按照TB Green Premix Ex Taq 試劑盒說明書（Takara，Japan）進行，操作儀器為Roche LightCycler 480Ⅱ。PCR 實驗以 GAPDH 作為內(nèi)源性對照，每個反應的溶解曲線只有一個峰才可視為有效結(jié)果。實驗重復3 次。

1.8 CCK-8 法檢測細胞增殖

處于對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化及離心后，用完全培養(yǎng)基重懸成單細胞懸液，計數(shù)后將細胞接種至96 孔板，密度為1000 個/孔，每孔完全培養(yǎng)基為100 μL。置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，沿孔壁緩慢加入10 μL CCK-8 試劑，輕微搖勻后置于細胞培養(yǎng)箱中，待孵育1 h 后使用酶標儀在450 nm 處檢測每個孔的吸光值。同樣的方法檢測第24 h、48 h、72 h、96 h 的吸光值。實驗重復3 次。

1.9 Edu 法檢測細胞增殖

按3000 個/孔的密度將細胞接種于96 孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按照試劑盒說明書加入預先配置好的1X Edu 溶液，細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄去Edu 溶液，4%多聚甲醛固定15 min，用0.3%TritonX-100/PBS 溶液室溫孵育15 min 進行膜通透處理，用Hoechst 給細胞核染色后于熒光顯微鏡下拍照保存、計數(shù)。實驗重復3 次。

1.10 克隆形成實驗

按每孔1000 個細胞接種于6 孔板中，混勻后置于細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度保持37℃，二氧化碳體積濃度比維持5%，每2～3 d 給細胞換液。待細胞長出明顯的單細胞克隆后，吸去孔中培養(yǎng)基，PBS 清洗后加入4%多聚甲醛固定15 min，加入0.1%結(jié)晶紫溶液給細胞染色30 min，用ddH2O 洗去殘留的結(jié)晶紫溶液，晾干后拍照、計數(shù)。實驗重復3 次。

1.11 Transwell 細胞遷移侵襲實驗

基質(zhì)膠提前一晚放于冰上化凍，用預冷的無血清DMEM 培養(yǎng)基按1∶3 的比例稀釋基質(zhì)膠，將80 μL 稀釋后的凝膠滴入 8 μm 孔徑的 Transwell 小室上室面，使凝膠鋪勻后，室溫靜置2 min 后吸去60 μL，上室面留下 20 μL 稀釋后的基質(zhì)膠，放入細胞培養(yǎng)箱2 h 待其凝固備用。將細胞消化離心，用PBS 洗去殘留的培養(yǎng)基，再次離心后用無血清的DMEM 重懸計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×105個/mL，分別取 200 μL 加入上室，下室加入 700 μL 含 10%血清的DMEM 完全培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，棄去上室中培養(yǎng)液，PBS 清洗后置于4%多聚甲醛中固定15 min，PBS 清洗后置于0.1%濃度的結(jié)晶紫中染色30 min，ddH2O洗去結(jié)晶紫，晾干后于顯微鏡下拍照計數(shù)。遷移實驗不鋪基質(zhì)膠，上室加入100 μL 細胞懸液，余實驗步驟相同。實驗重復3 次。

1.12 基因集富集分析

將TCGA 數(shù)據(jù)庫中的肝癌mRNA 表達數(shù)據(jù)根據(jù)YY1 表達高低進行分組，YY1 表達高于總體75%者歸于YY1 高表達組，表達低于總體25%者歸于YY1低表達組，兩組間的基因表達矩陣用于基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）［16］，選用c2.cp.kegg.v6.0.symbols.gmt 作為預定義基因集，分析與YY1 表達最相關(guān)的生物過程及信號通路。

1.13 基因富集分析

利用R 軟件包“clusterProfiler”對篩選出來的93 個YY1 共表達基因進行KEGG 富集分析和GO富集分析［17］，分析共表達基因的生物學功能。繪制柱狀圖：橫坐標為基因數(shù)，縱坐標為各信號通路，柱狀圖顏色代表p 值。

1.14 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）對93個YY1 共表達基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein -protein interaction network，PPI）［18］，置信度設(shè)置為0.7（高度可信），所得結(jié)果用Cytoscape 軟件行可視化分析。

1.15 統(tǒng)計學分析

本研究采用GraphPad Prism 8.0 及R 3.6.1 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。生存分析使用Kaplan-Meier法。體外細胞功能學實驗均重復3次，所有實驗數(shù)據(jù)顯示為3 次獨立實驗的均數(shù)±標準差。兩樣本之間比較，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊采用Studentt 檢驗；方差不齊的數(shù)據(jù)采用校正t檢驗。P＜0.05 時差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 YY1 在肝癌中表達上調(diào)且與不良預后相關(guān)

在TCGA 數(shù)據(jù)庫的肝癌隊列中發(fā)現(xiàn)，YY1 在肝癌中表達量顯著上調(diào)（圖1A），高表達YY1 的患者總體生存期（overall survival，OS）較短（圖1B）。其中，低表達YY1 的肝癌患者中位生存期為5.84 年，而高表達YY1 的肝癌患者中位生存期僅為3.14年。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在腫瘤體積分期為T3 及T4的患者中YY1 表達更高（10.36±3.64 vs 9.04±2.75，P＜0.01，圖1C）；腫瘤分期越晚（Ⅲ+Ⅳ）、組織學分化更差（Ⅲ+Ⅳ）的患者中YY1 表達顯著增加（圖1D-1E，P＜0.05），提示YY1 表達可能與肝癌增殖、惡性進展相關(guān)。在GSE14520、GSE25097 及ICGCLIRI-JP 肝癌驗證隊列中，我們發(fā)現(xiàn)YY1 在肝癌組織中表達量顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001，圖1F～1H）

2.2 YY1 在肝癌組織及細胞系中的表達情況

分析我院30 對肝癌及配對癌旁組織的YY1免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，YY1 集中表達在細胞核中，相比于癌旁組織，YY1 在肝癌組織內(nèi)陽性區(qū)域更多、染色更強（圖2A），肝癌組織的免疫評分顯著高于癌旁組織（P＜0.05，圖2B）。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，我們發(fā)現(xiàn)YY1 在BEL-7402、HepG2、Hep3B、Huh7、MHCC97H、HCCLM3 等肝癌細胞系中高表達，在PLC/PRF/5 中低表達（圖2C）。因此，我們使用敲降表達及過表達YY1 的慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細胞株；其中，肝癌細胞Huh7 敲降 YY1 表達，低表達 YY1 的 PLC/PRF/5 細胞則過表達 YY1。如圖 2D 中顯示，Huh7 敲低 YY1 表達后，蛋白水平明顯下降；PLC/PRF/5 經(jīng)過表達YY1后，蛋白水平也明顯增加。實時熒光定量PCR 實驗證實，在Huh7 中敲低YY1 表達后mRNA 水平明顯下降（P＜0.05，圖 2E）；PLC/PRF/5 中過表達YY1 組較對照組mRNA 的表達明顯上調(diào)（P＜0.05，圖2F）。

2.3 YY1 對肝癌細胞體外增殖功能的影響

在TCGA 數(shù)據(jù)庫肝癌研究隊列中，YY1 的表達與患者腫瘤大小顯著相關(guān)（圖1C）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，YY1 的表達水平與常見的增殖相關(guān)基因MKI67、PCNA 及MCM2 表達水平呈顯著正相關(guān)（Spearman相關(guān)系數(shù)分別為：Ki67：R=0.46，P＜0.0001；PCNA：R=0.44，P＜0.0001；MCM2：R=0.46，P＜0.0001；圖3A-3C）。體外CCK-8 檢測實驗顯示，在Huh7 中干擾YY1 表達后，細胞增殖減慢，在第 96 h 的 OD450 顯著低于對照組（1.040±0.092vs1.447±0.099，P＜0.01，圖 3D）；PLC/PRF/5 過表達YY1 后細胞增殖顯著加快，PLC/PRF/5-YY1 在第96 h 的吸光值顯著高于對照組（1.266±0.053vs0.963±0.041，P＜0.001，圖3F）。在 Edu 增殖檢測實驗中，Huh7-shYY1 組較對照Huh7-shCon 組Edu 陽性的細胞比例明顯減少（P＜0.001，圖3E），提示細胞增殖比例下降；在PLC/PRF/5-YY1 相比于對照組細胞，Edu 陽性細胞占比則有所增加（P＜0.01，圖3G）?？寺⌒纬蓪嶒炛邪l(fā)現(xiàn)，Huh7 干擾YY1 表達后，其克隆形成數(shù)目（392±55.6）少于對照組（151.3±66.9），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖3H）。而過表達YY1 的PLC/PRF/5 細胞克隆形成數(shù)目（446.7±39.5）顯著多于對照組（306±41，P＜0.05，圖3I）。以上實驗結(jié)果提示YY1 可影響肝癌細胞的增殖能力，提示YY1 可能在促進肝癌增殖、生長中發(fā)揮了重要的作用。

圖1 YY1 在肝癌組織中的表達情況圖 A：YY1 在TCGA-LIHC 中的表達情況（t 檢驗）；B：TCGA-LIHC 中YY1 表達與患者總體生存期相關(guān)（Kaplan-Meier 法，log-rank 檢驗）；C、D、E：YY1 在TCGA-LIHC 中與腫瘤體積、腫瘤分期、病理學分級相關(guān)（t 檢驗）；F：YY1 在GSE14520 中的表達情況（t 檢驗）；G：YY1 在GSE25097 中的表達情況（t 檢驗）；H：YY1 在ICGC-LIRI-JP 中的表達情況（t 檢驗）

2.4 YY1 對肝癌細胞體外遷移侵襲能力的影響

Transwell 細胞遷移、侵襲實驗顯示，Huh7 干擾YY1 表達后，Huh7-shYY1 組 24 h 的細胞遷移數(shù)（62.7±11.7）較對照組（118.3±7.6）明顯減少；侵襲細胞數(shù) Huh7-shYY1 組為 49±2，對照組為 100.7±10.5，遷移、侵襲細胞數(shù)兩組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖 4A）。過表達 YY1 的 PLC/PRF/5 細胞中，24 h 遷移及侵襲細胞數(shù)較對照組均明顯增加（遷移細胞數(shù)：220.7±14.3vs59.7±13；侵襲細胞數(shù)：176.3±15.5vs38±8），兩組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4B）。因此，體外實驗證實YY1 可以促進肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

2.5 YY1 與基因集富集分析

圖2 YY1 在肝癌組織及肝癌細胞系中的表達情況 A：YY1 在肝癌組織及配對癌旁組織的免疫組化染色；B：YY1 在30 對肝癌組織及配對癌旁組織的免疫評分（t 檢驗）；C：肝癌細胞系中YY1 的本底表達情況；D：蛋白免疫印跡實驗檢測YY1 敲降表達及過表達效果；E：q-PCR 實驗檢測YY1 敲降表達及過表達效果（t 檢驗）

基因集富集分析比較TCGA-LIHC 中高、低表達YY1 兩組之間差異的信號通路，我們發(fā)現(xiàn)YY1高表達組中富集了多種腫瘤相關(guān)的通路，比如KEGG-PATHWAYS-IN-CANCER、KEGG-CELL-CYCLE、KEGG-APOPTOSIS 和 KEGG-VEGF-SIGNALING-PATHWAY。同時，參與腫瘤發(fā)生及進展相關(guān)的分子信號通路，比如KEGG-ERBB-SIGNALINGPATHWAY、KEGG-MAPK-SIGNALING-PATHWAY、KEGG-NOTCH-SIGNALING-PATHWAY 及KEGGWNT-SIGNALING-PATHWAY也顯著富集于YY1高表達組中（圖5A，P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05）。這些結(jié)果提示YY1 的表達上調(diào)可能會激活這些信號通路從而促進肝癌進展。

2.6 YY1 與基因共表達分析

具有類似表達模式的基因可能參與相近的分子生物學功能，因此，我們篩選TCGA、GEO 及ICGC 數(shù)據(jù)庫中與YY1 表達顯著相關(guān)的基因，我們將與YY1 表達相關(guān)系數(shù)絕對值超過0.4，p 值小于0.05 的基因定義為YY1 的共表達基因，四個不同的肝癌研究隊列中篩選出93 個共表達基因（圖5B）。經(jīng)過KEGG 通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)這些共表達基因主要參與了基因復制及基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的信號通路，比如DNA 復制、RNA 轉(zhuǎn)運及細胞周期等（圖5C）。在GO 通路富集分析中，這些共表達基因參與了P53基因介導的信號轉(zhuǎn)導，tRNA轉(zhuǎn)運及DNA 復制等（圖5D）。進一步分析中，我們通過String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建YY1 與這些共表達基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，在置信度為0.7（高度可信）時，我們發(fā)現(xiàn)93 個共表達基因之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)（249）比預期的互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)（60）顯著增加（PPI enrichmentPvalue=1.0×10-16）。其中預測到 YY1 與8 個蛋白存在高度可信的互作網(wǎng)絡(luò)，包括FKBP3、RBBP7、H2AFV、ACTL6A、PAXIL1、NCOA6、SUZ12和H2AFZ，提示YY1可能與這8個共表達基因存在相互作用關(guān)系，參與調(diào)控相應的分子生物學功能。

3 討 論

YY1 是1991 年被發(fā)現(xiàn)并純化的鋅指類轉(zhuǎn)錄因子，屬于GL1-Kruppel 蛋白質(zhì)家族，編碼基因位于人類14 號染色體端粒區(qū)q32.2，序列在脊椎動物中高度保守［19，20］。作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，YY1可以影響大約7%的哺乳動物基因的轉(zhuǎn)錄活性，通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、大規(guī)模染色體重組及X 染色體失活等參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等生物學過程［21］。多項研究表明YY1 在多種腫瘤中異常表達，發(fā)揮抑癌或促癌作用。如在乳腺癌、胰腺導管腺癌及食管鱗狀細胞癌中，YY1 能抑制腫瘤進展［7-10］，而在肺癌、胃癌及結(jié)直腸癌中則發(fā)揮促癌作用［11-13］。在肝癌的研究中，Kim 等人報道 YY1 在細胞核中的表達上調(diào)與肝癌不良預后相關(guān)［14］，Tsang 等人分析50 對肝癌與配對癌旁組織免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，YY1 在68%的肝癌組織中表達量明顯增加［22］。而在Wang LM 等人的報道中，他們分析了80 對肝癌組織及配對癌旁組織的mRNA 表達水平，發(fā)現(xiàn)65%肝癌組織中YY1 表達低于癌旁組織，而且高表達YY1 的患者肝癌組織病理學分級較好，指出YY1高表達在肝癌中是保護因素而非危險因素［15］。因而不能將YY1 籠統(tǒng)地歸為抑癌基因或癌基因，YY1 在不同腫瘤甚至同一腫瘤中功能的差異性可能與其特殊的結(jié)構(gòu)有關(guān)，YY1 蛋白包含多個不同的活性催化區(qū)域一方面可直接識別結(jié)合啟動子區(qū)的YY1 應答元件促進靶基因轉(zhuǎn)錄，另一方面還可以通過招募共激活因子（如p300、CBP或PRMT1 等）或共抑制因子（如HDACs、EZH2 或DNMTs）改變下游基因YY1 應答元件附近染色質(zhì)的表觀遺傳修飾狀態(tài)，促進或抑制下游基因的表達［23，24］。

圖3 YY1 對肝癌細胞增殖和克隆形成能力的影響 A、B、C：YY1 在TCGA-LIHC 中與增殖相關(guān)基因MKI67、PCNA 和MCM2 顯著正相關(guān)（Spearman 相關(guān)性分析）；D、F：CCK-8 實驗檢測敲降或過表達YY1 后細胞增殖情況（t 檢驗）；E、G：Edu 染色法檢測敲降或過表達YY1后細胞增殖情況（t 檢驗）；H、I：敲降或過表達YY1 后細胞克隆形成能力改變情況（t 檢驗）

圖4 YY1 對肝癌細胞遷移、侵襲能力的影響 A：敲降YY1 表達后Huh7 遷移、侵襲能力顯著降低（t 檢驗）；B：過表達YY1 后PLC/PRF/5 遷移、侵襲能力顯著增強（t 檢驗）

圖5 基因集富集分析、基因共表達分析及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 A：YY1 高表達的HCC 患者明顯富集多種與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路；B：篩選并確定93 個TCGA-LIHC、GSE14520、GSE25097 及ICGC-LIRI-JP 數(shù)據(jù)集中的YY1 過表達基因；C、D：93 個YY1 共表達基因的KEGG、GO 通路富集分析；E：構(gòu)建YY1 與共表達基因之間的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

本研究分析TCGA-LIHC、GSE14520、GSE25097及ICGC-LIRI-JP 四個肝細胞癌研究隊列中YY1 的表達及臨床意義，并在本院收集的樣本中進行驗證，分析結(jié)果均顯示YY1 在肝癌組織中的表達顯著高于正常肝組織，且YY1 高表達能指示患者的不良預后。值得注意的是YY1 與腫瘤體積、腫瘤分期、腫瘤病理學分級密切相關(guān)，提示YY1 可能在多方面影響腫瘤進展。我們的體外實驗結(jié)果顯示，YY1 可以促進肝癌細胞增殖、遷移及侵襲，進一步證實YY1 確實可以從多個方面影響到肝癌細胞。在探討YY1 在肝癌中發(fā)揮作用的潛在機制時，我們分析了TCGA-LIHC 研究隊列的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，與預期一致，結(jié)果顯示YY1 高表達組富集到更多與腫瘤發(fā)生及進展相關(guān)的信號通路。此外，分析YY1 的共表達基因并構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，YY1 與這些共表達基因參與DNA 復制、RNA 轉(zhuǎn)運及細胞周期等生物學過程，進一步提示轉(zhuǎn)錄因子YY1 在肝癌中可能廣泛參與調(diào)控基因復制及轉(zhuǎn)錄；預測到與YY1 存在高度可信的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的基因可能是YY1 的下游靶基因，這可以為我們后續(xù)的機制研究提供參考和方向。

綜上所述，本研究初步探討了YY1 基因在肝癌中的預后意義，體外實驗證明YY1 可以促進肝癌細胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化能力，靶向干擾肝癌組織中的YY1 表達可能是潛在的藥物治療靶點。