張 英 宋曉紅 郭海云

1.河北省張家口市婦幼保健院(075000)；2.北京世紀(jì)壇醫(yī)院

miRNA是一類非編碼的單鏈小分子RNA[1]。通過基因調(diào)控參加真核細(xì)胞生物學(xué)翻譯過程。由于腫瘤與miRNA聯(lián)系緊密，腫瘤miRNA研究成為熱點[2-5]。以往研究顯示，肝癌、胰腺癌等與miR-183在組織中的異常應(yīng)答可能有緊密關(guān)聯(lián)[3-5]。為探究miR-183的異常應(yīng)答在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的影響，本研究對卵巢癌細(xì)胞中miR-183的表達(dá)水平和過表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞的影響分析，探討mir-183在卵巢癌發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

經(jīng)本院倫理委員會同意，選取本院2018年9月-2020年9月卵巢癌組織切片和其鄰近組織切片標(biāo)本40例,癌組織細(xì)胞為卵巢癌組織內(nèi)細(xì)胞，癌旁組織細(xì)胞為卵巢癌組織范圍2cm處沒有癌變或壞死組織?；颊呤中g(shù)前3個月沒有接受任何藥物或其他相關(guān)的抗癌治療，均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株以及試劑

中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購進(jìn)人卵巢腺癌細(xì)胞(SKOV3)和人卵巢癌細(xì)胞(OVCAR3)；上海素爾生物科技有限公司購入SH30809的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、SH30033的DMEM培養(yǎng)基、SH30084的胎牛血清(FBS)、SH30042的0.25%胰蛋白酶、SH30256的10xPBS；美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司購買4366596的Taqman microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、4324018的Taqman通用PCR主混合物；美國英杰生命技術(shù)有限公司購入15596-026的Trizol試劑、11668027的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑；美國BD 公司購入556547的膜聯(lián)蛋白v-fitc/pi凋亡檢測試劑盒；西格瑪奧德里奇公司購入M2128的噻唑藍(lán)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出兩株SKOV3和OVCAR3細(xì)胞復(fù)蘇，1200r/min離心3min棄上清，用1ml10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基混勻，置培養(yǎng)瓶中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)孵育。當(dāng)細(xì)胞密度70%～80%時傳代培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：合成MIR-183類似物和陰性對照類似物(表1)，嚴(yán)格按照美國英杰生命技術(shù)有限公司Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表1 miR-183序列信息

1.4 卵巢癌細(xì)胞系全RNA的抽提

將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于冰上，加入Trizol試劑裂解5min，用加樣器槍頭輕輕吹打后吸取液體入EP管中；加入1/5體積氯仿混勻，4℃靜置10～15min，4℃ 離心15min取上清。加入等體積異丙醇，4℃靜置10min，12000rpm離心10min。取出EP管后避開側(cè)壁沉淀，輕輕吸棄上清；向EP管中加入75%酒精洗滌，靜置1～2min，4℃離心5min，輕輕吸棄上清；將EP管再次放于離心機(jī)中瞬時離心，棄掉管壁殘余液體。將EP管置超凈臺中干燥5～10min。加入50μl DEPC處理水，震蕩溶解沉淀。測量RNA濃度后-80℃保存。

1.5 熒光定量PCR和RNA的反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)ABI公司Taqman microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，獲得互補DNA(cDNA)產(chǎn)物。反應(yīng)條件：16°C孵育30min，42°C孵育30min，85°C孵育5min，4°C儲存。以獲得的cDNA為模板，使用Taqman通用PCR主混合物20μl反應(yīng)系統(tǒng)在羅氏Lightcycler 480儀器上行熒光定量PCR。u6為表達(dá)檢測的內(nèi)部參照物，△ct為mir-183相對表達(dá)(△CT=|CTmiR-183-CTU6|)。反應(yīng)條件：在95°C時預(yù)處理10min，40×95°C 15s，60°C 30s，70°C30s循環(huán)周期。

1.6 MTT檢測癌細(xì)胞增殖活力

將mir-183類似物和陰性對照類似物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種5×103個細(xì)胞；觀察0h、24h、48h、72h細(xì)胞狀態(tài)，每孔加入20μl 5 mg/LMTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h；取出96孔板，每孔加入120μl二甲基亞砜混勻，酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度(OD值)為細(xì)胞增殖能力。

1.7 癌細(xì)胞凋亡率檢測

將mir-183類似物和陰性對照類似物轉(zhuǎn)染24h的人卵巢癌細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。將卵巢癌細(xì)胞1%CO2培育48h，用100μl 0.25%胰蛋白酶消化，將細(xì)胞收集于離心管中。避光加入5μl膜聯(lián)蛋白V和5ul碘化丙啶，充分混勻，室溫下無光孵育20min后用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分選檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 癌組織miR-183的表達(dá)

以U6作為癌細(xì)胞的內(nèi)部對照，卵巢癌患者癌組織中miR-183(2.75±1.02)表達(dá)低于癌旁組織(5.43±1.27)(t=10.41,P<0.05)。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-183 mimics 的人卵巢癌細(xì)胞增殖活性

SKOV3和OVCAR3人卵巢癌細(xì)胞株依據(jù)轉(zhuǎn)染情況，分為空白對照組(未轉(zhuǎn)染microRNA)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染的擬態(tài)對照)與轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染的mir-183擬態(tài))。轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、73h時MTT法測定細(xì)胞OD值。結(jié)果顯示，在SKOV3細(xì)胞株中，24h時空白對照組和陰性對照組OD值均高于轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，但4個時間點陰性對照組和空白對照組OD值沒有差別(P>0.05)。見表2；在OVCAR3細(xì)胞株中，48h時空白對照組和陰性對照組OD值均高于轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，陰性與空白對照組在4個時點OD值沒有差別(P>0.05)。見表3。

表2 各時間點SKOV3細(xì)胞系OD值比較

表3 各時間點OVCAR3細(xì)胞系OD值比較

2.3 轉(zhuǎn)染miR-183 mimics人卵巢癌細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示(圖1、圖2，2485頁)，在OVCAR3、SKOV3細(xì)胞株中，mir-183類似物轉(zhuǎn)染48h后，細(xì)胞凋亡率空白和陰性對照組無差異(P>0.05)但均低于轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。見表4。

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較

3 討論

卵巢癌因其隱蔽發(fā)病致早期診斷困難，臨床發(fā)現(xiàn)時70%以上患者為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，致使5年生存期<30%[6]。研究表明，腫瘤抑制基因p53的轉(zhuǎn)錄因子mir34b和mir-34c調(diào)控使卵巢癌發(fā)生[7]；mir-214影響卵巢癌轉(zhuǎn)移[8]。miRNA通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞分化與增殖[5，9]；介入細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞凋亡；調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號通路傳遞介入等[10]。有研究檢測人卵巢癌細(xì)胞系和正常卵巢上皮細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜，利用miRNA芯片技術(shù)共檢測到miRNA173個，有160個在兩個細(xì)胞系中有共同應(yīng)答，但有35個應(yīng)答有差異，其中31個下調(diào)、4個上調(diào)，且其中2個miRNA有腫瘤抑制作用，揭示了miRNA與卵巢癌的相關(guān)性[11]；有學(xué)者對106例早期和晚期卵巢癌患者miRNA表達(dá)，顯示兩組有44個非編碼小分子RNA基因應(yīng)答不同，晚期卵巢癌患者這44個miRNA基因應(yīng)答下調(diào)，且包含有mir34a和mir15a抑制腫瘤功能基因，說明miRNA在卵巢癌的發(fā)展中發(fā)揮主要作用[12]。Iorio等[13]研究發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢腫瘤與正常卵巢組織存在不同表達(dá)的miRNA,通過對上皮性卵巢腫瘤中漿液性囊腺瘤、透明細(xì)胞中腎樣瘤和卵巢子宮內(nèi)膜樣腫瘤的研究，證實了在腫瘤中存在miRNA的異常表達(dá)和突變,且發(fā)現(xiàn)miR-183家族成員中的miR-182在卵巢子宮內(nèi)膜樣腫瘤中存在特異性高表達(dá)。

在本研究，卵巢癌患者癌鄰近組織內(nèi)miR-183高于癌組織水平，說明卵巢癌組織中miR-183發(fā)生下調(diào)；在轉(zhuǎn)染miR-183 mimics于SKOV3和OVCAR3人卵巢癌細(xì)胞株實驗中，轉(zhuǎn)染組人卵巢癌細(xì)胞增殖活性低于空白對照和陰性對照組，說明miR-183的過表達(dá)能夠降低卵巢癌細(xì)胞增殖活性；在轉(zhuǎn)染miR-183 mimics于SKOV3細(xì)胞系實驗中，轉(zhuǎn)染組人卵巢癌細(xì)胞凋亡率高于空白對照和陰性對照組，說明miR-183 能促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞凋亡。在卵巢癌細(xì)胞中，miR-183的高表達(dá)破壞了卵巢癌細(xì)胞的正常生理功能。Fan等[14]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中miR-183同樣能直接靶向作用于MMP-9，水平下降能抑制卵巢癌增殖，促進(jìn)卵巢癌凋亡。近期Lee等[15]在子宮內(nèi)膜癌研究中也證實了miR-183家族成員與抑癌基因PTEN的相關(guān)性。在卵巢癌組織中或某一組織類型卵巢腫瘤中, 過表達(dá)的miR-183家族成員對癌基因或抑癌基因的調(diào)節(jié)作用還有待進(jìn)一步探討。在卵巢癌中，miR-183的低水平表達(dá)，是卵巢癌相關(guān)基因或蛋白直接或間接與miR-183 發(fā)生作用，在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平負(fù)調(diào)控miR-183。一定程度上，miR-183 的表達(dá)水平越低，卵巢癌細(xì)胞的增殖能力越強。

綜上所述，在卵巢癌發(fā)展過程中，miR-183發(fā)揮著重要調(diào)控作用，卵巢癌的增殖與凋亡與miR-183有緊密聯(lián)系。對于卵巢癌組織中miR-183低水平表達(dá)有關(guān)機(jī)理仍需深入探討，有望利用卵巢癌和miR-183這一關(guān)系理論應(yīng)用于臨床治療卵巢癌。