邸 曼 張千峰 王晶晶 楊弘睚 王曉紅*

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安，710038)；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院

子宮內(nèi)膜受卵巢激素調(diào)節(jié)具有增殖活性和周期性更新的特性[1]。子宮內(nèi)膜的來源與骨髓干細胞及內(nèi)膜中殘留的胚胎干細胞有關(guān)[2]。胎盤間充質(zhì)干細胞(PMSCs)具備高自我更新和多向分化能力。子宮內(nèi)膜損傷可出現(xiàn)大量的瘢痕化，導(dǎo)致子宮供血不足影響胚胎著床[3]。隨著干細胞技術(shù)發(fā)展，臨床上開始使用干細胞誘導(dǎo)分化，修復(fù)子宮內(nèi)膜。本研究以體外模擬子宮微環(huán)境，誘導(dǎo)大鼠PMSCs分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞，為修復(fù)子宮內(nèi)膜提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2月齡SD大鼠，體重150～180g，購自南京君科生物工程有限公司。DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，兔抗大鼠波形蛋白抗體、小鼠抗大鼠角蛋白抗體(美國Gibco公司)，兔抗大鼠CK7、CK18、CK19、EMA抗體均購自上海鈺博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠PMSCs原代培養(yǎng)及傳代將雌、雄大鼠合籠，取孕13.5d的SD雌鼠安樂處死，分離胎盤并置于混合酶內(nèi)消化，用DMEM培養(yǎng)液制成懸液，置培養(yǎng)箱傳代。

1.2.2細胞生長曲線測定取PMSCs制備單細胞懸液并調(diào)整濃度為2×104/ml，接種到24孔板并培養(yǎng)，繪制14d生長曲線。

1.2.3子宮內(nèi)膜誘導(dǎo)培養(yǎng)液的制備取正常未孕雌鼠，全麻，在無菌條件取雙側(cè)子宮，加入DMEM培養(yǎng)基，離心取上清，-20℃保存。

1.2.4大鼠PMSCs體外誘導(dǎo)分化子宮內(nèi)膜細胞取大鼠第3代PMSCs加入消化酶，細胞變類圓形終止消化，制成濃度為1×106/ml細胞懸液并接種于培養(yǎng)皿,加入子宮內(nèi)膜誘導(dǎo)培養(yǎng)液，培養(yǎng)19d，對照組以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。當大多數(shù)扁平梭形細胞變圓時終止消化。

1.2.5免疫熒光化學(xué)法檢測細胞中波形蛋白和角蛋白表達取大鼠第3代PMSCs分為實驗組和對照組，實驗組以1×10-7mol/Lβ-雌二醇及20%子宮內(nèi)膜誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)，對照組以牛血清培養(yǎng)。鏡下觀察細胞的形態(tài)和增殖。以多聚甲醛固定，免疫熒光化學(xué)法檢測波形蛋白和角蛋白。

1.2.6RT-PCR檢查CK7、CK18、CK19、EMAmRNA表達分組同1.2.5。采用RT-PCR檢測CK7、CK18、CK19、EMA mRNA表達，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件：94℃反應(yīng)1min，55℃反應(yīng)1min，72℃反應(yīng)1min，35個循環(huán)，72℃延長5min。

1.2.7Westernblot檢測波形蛋白和角蛋白表達量分組同1.2.5。每組加細胞裂解液提取總蛋白，以Western blot檢測波形蛋白和角蛋白，以β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠PMSCs形態(tài)

自接種至培養(yǎng)瓶時，原代細胞多呈現(xiàn)懸浮圓形；接種7d，倒置顯微鏡下可見細胞貼壁生長，圓形細胞開始延伸，變成為梭形或不規(guī)則形，輪廓清晰，部分細胞呈圓形；培養(yǎng)14d，細胞幾乎鋪滿瓶，細胞漩渦狀排列，均為長梭形，可傳代。

2.2 細胞生長曲線

細胞數(shù)量呈現(xiàn)增長趨勢，與培養(yǎng)天數(shù)相關(guān)。

2.3 大鼠PMSCs分化為宮內(nèi)膜上皮細胞的形態(tài)特征、角蛋白及波形蛋白表達

誘導(dǎo)14d，細胞呈基質(zhì)細胞改變排列雜亂，核不明顯呈梭形或扁平；部分細胞多角形排列成團，核較圓而大，呈現(xiàn)出上皮細胞改變。用胰酶消化時間差法去除基質(zhì)細胞，加入胰酶1min時，扁平的梭形細胞開始回縮；再消化10min可見扁平梭形細胞基本變圓，多角形細胞仍處于貼壁狀態(tài)。經(jīng)過上述消化過程，培養(yǎng)皿內(nèi)大部分為多角形的上皮細胞，仍混有部分基質(zhì)細胞；培養(yǎng)2～3d，重復(fù)上述消化步驟得到高純度上皮細胞,上皮細胞排列成團、核圓而大。細胞免疫熒光顯示，實驗組大部分細胞呈綠色熒光，即為角蛋白表達；對照組僅胞核為藍色熒光，說明PMSCs表達波形蛋白但不表達角蛋白，誘導(dǎo)后的細胞角蛋白陽性，即呈現(xiàn)上皮細胞改變。見圖1(2485頁)和圖2(2485頁)。

2.4 CK7、CK18、CK19、EMA mRNA表達比較

實驗組CK7、CK18、CK19、EMA mRNA表達均高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組CK7、CK18、CK19、EMAmRNA相對表達量比較

2.5 波形蛋白和角蛋白的表達比較

實驗組波形蛋白表達(0.32±0.16)低于對照組(0.88±0.31)，角蛋白表達(2.91±1.07)高于對照組(1.04±0.01)(t=7.230、3.495，P=0.005、0.040)。

3 討論

PMSCs具有分化為成骨細胞、子宮內(nèi)膜上皮細胞等多種類型細胞潛能[15]。基底層是子宮內(nèi)膜的重要組成部分，與月經(jīng)周期、功能層更新、脫落及再生等生理功能緊密相關(guān)[4]。因而子宮內(nèi)膜受到損傷可影響生殖能力[5]。

在人和大鼠的子宮內(nèi)膜微環(huán)境中，PMSCs可分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞[6]。如本文結(jié)果顯示，取孕13.5d的SD大鼠胎盤分離得到PMSCs，自接種至培養(yǎng)瓶時，原代細胞多呈現(xiàn)懸浮圓形；接種7d鏡下可見細胞貼瓶壁生長，圓形細胞開始延伸，變成為梭形或不規(guī)則形；培養(yǎng)14d后細胞幾乎鋪滿瓶，呈漩渦狀的長梭形細胞。加入子宮內(nèi)膜誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，當大多數(shù)細胞變圓排列成團時，提示PMSCs分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞。子宮內(nèi)膜上皮細胞具有良好的修復(fù)功能，可促進受損的子宮內(nèi)膜妊娠。如有研究表明[7]，采用機械法制備宮腔粘連大鼠模型，與模型組相比，股靜脈注射臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體大鼠的炎癥顯著消退，膠原纖維組織消減，子宮內(nèi)膜基本恢復(fù)正常，修復(fù)損傷子宮內(nèi)膜并成功妊娠；人源骨髓間質(zhì)充質(zhì)干細胞遷移到受損的子宮內(nèi)膜血管，通過旁分泌分子誘導(dǎo)內(nèi)膜周圍的細胞增殖，提高內(nèi)膜的抗炎功能，促進子宮內(nèi)膜增殖[8]。本研究通過制備子宮內(nèi)膜誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液，模擬子宮內(nèi)膜微環(huán)境，誘導(dǎo)PMSCs分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞，使用子宮內(nèi)膜誘導(dǎo)培養(yǎng)液及1×10-7mol/Lβ-雌二醇培養(yǎng)，分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞。與文獻報道一致[9]。

細胞角蛋白可有效維持上皮細胞的形態(tài)完整性[10]。波形蛋白可維持細胞器和細胞核之間的特定空間。本研究顯示，實驗組PMSCs細胞的波形蛋白表達降低，角蛋白表達增高，進一步證實誘導(dǎo)后PMSCs成功向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化。與文獻報道一致[11]。另外本研究結(jié)果顯示，實驗組CK7、CK18、CK19與EMA等表達均高于對照組，說明實驗組模擬子宮微環(huán)境成功誘導(dǎo)了PMSCs分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞。與文獻報道一致[12]。

綜上，在內(nèi)源性間質(zhì)干細胞和外源性因素作用下(如子宮內(nèi)膜誘導(dǎo)培養(yǎng)液與雌激素)，PMSCs可分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞，為不孕患者使用PMSCs治療提供一定理論依據(jù)。