解笑宸 于斐 姚粵峰 林健靜 年夢(mèng)圓 曾暉

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，骨科生物材料國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東深圳 518036）

第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chro?mosome 10,PTEN），位于人染色體10q23.3[1]，是一個(gè)由8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子構(gòu)成的200 kb的基因，是繼p53基因后研究較多的一種具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[2]。其翻譯后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)屬于酪氨酸磷酸酶家族成員，分子量58～60 kDa，由N末端、C2結(jié)構(gòu)域及C末端組成[3]。PTEN基因的最初發(fā)現(xiàn)是因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)磷酸酯酶作用行使抑癌基因的功能，從而調(diào)控細(xì)胞周期，影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂，并抑制其過(guò)快的增殖分裂[4]。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)PTEN基因在骨關(guān)節(jié)炎[5]、周圍神經(jīng)損傷[6]、骨肉瘤[7]及軟骨發(fā)育不全[8]等疾病中起重要作用，其可以通過(guò)Wnt[9]、PI3K/AKT[10]、NF-κB[11]等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響機(jī)體中細(xì)胞炎性因子相關(guān)免疫反應(yīng)[12]、細(xì)胞凋亡[13]、神經(jīng)元軸突再生[14]等過(guò)程參與到骨科疾病[15]的病理生理過(guò)程中，也因此PTEN基因受到骨科醫(yī)師的重視。

RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系是由原代培養(yǎng)的大鼠施萬(wàn)細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后自發(fā)轉(zhuǎn)化形成的，傳代次數(shù)較多，該細(xì)胞在特定因子的刺激下能夠表現(xiàn)出原代施萬(wàn)細(xì)胞的特性，并且能夠快速的分裂增殖，滿足細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞量使用較大的需求，在創(chuàng)傷骨科、脊柱外科等領(lǐng)域的神經(jīng)相關(guān)疾病的研究中應(yīng)用廣泛[16,17]，比如在脊髓損傷[18]、周圍神經(jīng)缺損[19]研究中受到青睞。

目前，慢病毒轉(zhuǎn)染敲減細(xì)胞中的基因表達(dá)是研究中比較新穎并且可靠的方法。通過(guò)細(xì)胞模型的建立，能夠在細(xì)胞層面結(jié)合功能及機(jī)制檢測(cè)方法解釋疾病發(fā)生發(fā)展的原因，從而為實(shí)驗(yàn)研究提供便利，為臨床治療提供相應(yīng)靶點(diǎn)。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，PTEN基因表達(dá)降低的RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系模型鮮有報(bào)道，通過(guò)建立該細(xì)胞模型，結(jié)合細(xì)胞系可以多次傳代的優(yōu)勢(shì)，我們可以在施萬(wàn)細(xì)胞系中探討PTEN基因敲減通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路如PI3K/AKT/mTOR、wnt/β-catenin等影響施萬(wàn)細(xì)胞的增殖及凋亡情況，進(jìn)而解釋脊髓損傷、周圍神經(jīng)缺損的發(fā)生發(fā)展原因，尋找促進(jìn)損傷修復(fù)的方法及可能機(jī)制。因此，本研究應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低了RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系中PTEN基因的表達(dá)，為研究骨科疾病提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系（中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供），質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN公司提供），引物（上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司、GeneRay公司提供），Taq Plus DNA聚合酶（Vazmye公司提供），NormalRunTM250 bp-II DNA Ladder（GeneRay公司提供），Top10感受態(tài)細(xì)胞（Genechem公司提供），T4 DNA連接酶（Thermo Scien?tific公司提供），限制性核酸內(nèi)切酶（NEB公司提供），GeneRuler 1 kb DNA Ladder（Thermo Scientific公司提供），293T細(xì)胞（上海細(xì)胞所提供），HIV-1 p24 Antigen ELISA 2.0試劑盒（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供），吉?jiǎng)P轉(zhuǎn)染試劑（上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司提供），DMEM（Corning公司、Hyclone公司提供），胎牛血清（Ausbian公司、上海微科生化試劑有限公司提供），嘌呤霉素（Clontech公司、Sigma公司提供），胰酶（生工生物工程（上海）股份有限公司提供），DMSO（上海試一化學(xué)試劑有限公司提供），臺(tái)盼蘭（Sigma公司提供），D-Hanks（上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司提供），SYBR Master Mixture（TAKARA公司提供），RNA酶抑制劑（Promega公司提供），oligo dT（上海生工提供），M-MLV試劑盒（Promega公司提供），Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer試劑盒（廣州銳博公司提供），dNTPs（pro?mega公司提供），Trizol（上海普飛公司提供）。

1.2 RNAi慢病毒載體構(gòu)建

引入吉?jiǎng)P基因的AgeⅠ、EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)（酶切體系見(jiàn)表1），體系配好吹打均勻并短暫離心，37℃反應(yīng)3 h或過(guò)夜，產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶。針對(duì)PTEN基因序列，根據(jù)RNAi序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)一條大鼠PTEN-RNAi靶點(diǎn)序列AACCCACCACAGCTAGAACTT，GC含量47.62%，Start Pos.為280；對(duì)照插入序列TTCTCCGAACGTGT?CACGT。采用吉?jiǎng)P基因GV248（框架結(jié)構(gòu)hU6-MCSUbiquitin-EGFP-IRES-puromycin）載體構(gòu)建PTENRNAi-a和PTEN-RNAi-b兩條目的基因框架，以及CON-RNAi-a和CON-RNAi-b兩條對(duì)照基因框架（表2）。合成好的引物干粉溶于退火液，90℃水浴15 min，冷卻至室溫。T4DNA連接酶于16℃1～3 h或過(guò)夜連接退火雙鏈DNA和載體。產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆的菌落通過(guò)PCR進(jìn)行鑒定（PCR引物：+5’CCATGATTCCTTCATATTTGC3’；-5’ AT?GTCCTTCTGCTGATACTGGG 3’）。測(cè)序后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，合格的質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 酶切體系

1.3 RNAi慢病毒包裝

取培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中的生長(zhǎng)良好的293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前2 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基；無(wú)菌離心管中加入制備的各DNA溶液（含有GV載體質(zhì)粒20 μg、pHelp1.0載體質(zhì)粒15 μg、pHelp2.0載體質(zhì)粒10 μg），與一定體積的吉?jiǎng)P轉(zhuǎn)染試劑相混合，調(diào)整總體積為1 ml，室溫溫育15 min；滴加至293T細(xì)胞中混勻，于5%CO2、37℃下培養(yǎng)6 h；PBS洗滌轉(zhuǎn)染混合物；10%FBS、5%CO2、37℃下培養(yǎng)2～3 d；收集細(xì)胞上清液于4℃、4000g離心10 min；0.45 μm濾器過(guò)濾；含病毒的上清液于Beckman超速離心機(jī)中4℃、25000 rpm離心2 h；棄上清加病毒保存液重懸；10000 rpm離心5 min后分裝；對(duì)慢病毒進(jìn)行物理狀態(tài)、無(wú)菌、病毒滴度檢測(cè)。病毒滴度計(jì)算公式為：病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。

表2 PTEN-RNAi及對(duì)照構(gòu)建框架

1.4 細(xì)胞感染

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RSC96細(xì)胞，鋪12孔板，3～5×104個(gè)細(xì)胞/孔，待細(xì)胞長(zhǎng)至20%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為空白組、陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染組、PTEN-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染組3組，感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）為5或10，感染增強(qiáng)液Eni.S輔助感染。感染16 h時(shí)換液，感染72 h時(shí)進(jìn)行熒光拍照。

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)RSC96細(xì)胞中慢病毒轉(zhuǎn)染后PTEN基因mRNA的表達(dá)情況

以GAPDH為內(nèi)參基因，收集細(xì)胞用Trizol裂解液裂解，加入氯仿靜置10 min，12800 rpm、4℃離心15 min，取上層液體加入異丙醇4℃靜置10 min，12800 rpm、4℃離心15 min棄上清，75%乙醇洗滌，11800 rpm、4℃離心5 min棄上清，11800 rpm、4℃離心5 min再次棄上清，室溫干燥，RNA-free水溶解沉淀，分光光度計(jì)測(cè)RNA質(zhì)量及濃度。1 μl Oligo dT（0.5 μg/μl）和2 μg總RNA加RNA-free水配成10 μl溶液，離心后于70℃溫育10 min，冰育退火，用Promega M-MLV試劑盒配置反轉(zhuǎn)錄體系，42℃水浴1 h，70℃水浴10 min，cDNA產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。按RNA PCR體系配置溶液，二步法完成擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法開(kāi)展數(shù)據(jù)分析，引物序列見(jiàn)表3。

表3 PTEN及GAPDH引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組別樣本之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 21.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 PTEN基因RNAi慢病毒載體的制備及鑒定

轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后的陽(yáng)性克隆菌落PCR電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。在本模型建立過(guò)程中，連接入慢病毒短發(fā)夾狀RNA（vshRNA）片段的陽(yáng)性克隆PCR片段大小為534 bp，空載體克隆PCR片段大小為500 bp，通過(guò)軟 件 讀 取 可 知，ccggAACCCACCACAGC?TAGAACTTttcaagagaAAGTTCTAGCTGTGGT?GGGTTtttttg序列插入正確，PTEN-RNAi框架可用。

圖1 陽(yáng)性克隆電泳鑒定

2.2 攜帶PTEN基因的慢病毒包裝及滴度鑒定

將PTEN-RNAi慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，作用1 d后，熒光顯微鏡下觀察293T細(xì)胞中熒光表現(xiàn)情況（圖2）。根據(jù)病毒滴度計(jì)算公式得，該慢病毒的滴度為8E+8TU/mL。

2.3 攜帶PTEN基因的慢病毒的質(zhì)量檢測(cè)

細(xì)胞中若存在支原體、衣原體、細(xì)菌、真菌或內(nèi)毒素等病原微生物時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了避免這些病原微生物的作用，我們采用NESTPCR檢測(cè)支原體，采用培養(yǎng)法檢測(cè)衣原體、細(xì)菌和真菌，采用LAL法檢測(cè)內(nèi)毒素，結(jié)果顯示PTEN-RNAi慢病毒中支原體、衣原體、細(xì)菌、真菌和內(nèi)毒素均為陰性，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 攜帶PTEN基因的慢病毒感染RSC96細(xì)胞

圖2 PTEN-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（200×）

RSC96施萬(wàn)細(xì)胞鋪12孔板后，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到20%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用病毒滴度為8E+8TU/ml的PTEN-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染，當(dāng)MOI為10時(shí)，使用慢病毒1.25μl；當(dāng)MOI為5時(shí)，使用慢病毒0.625 μl。用病毒滴度為1E+9TU/mL的陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染，當(dāng)MOI為10時(shí)，使用慢病毒1μl；當(dāng)MOI為5時(shí)，使用慢病毒0.5 μl（圖3、4）。轉(zhuǎn)染后的RSC96施萬(wàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)污染，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 攜帶PTEN基因的慢病毒感染RSC96細(xì)胞后細(xì)胞中PTEN基因mRNA的表達(dá)情況

通過(guò)RT-PCR檢測(cè)RSC96施萬(wàn)細(xì)胞中PTEN基因的敲減情況。陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染組和PTENRNAi慢病毒轉(zhuǎn)染組均感染3次，陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染組PTEN基因mRNA的表達(dá)情況分別為1.0067±0.1370、1.0023±0.0886、1.0043±0.1141，PTEN-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染組PTEN基因的表達(dá)情況分別為0.2533±0.0185、0.2177±0.0186、0.2257±0.0200，3次感染均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。感染3次后，計(jì)算3次平均值作為RSC96細(xì)胞中PTEN基因的相對(duì)表達(dá)量，PTEN基因的相對(duì)表達(dá)量在陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染組為1.0044±0.0022，在PTEN-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染組為0.2322±0.0187，敲減效率為76.78%，兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，圖5）。由此可知，我們?cè)O(shè)計(jì)的AACCCACCACAGCTAGAACTT靶點(diǎn)序列是一個(gè)有效的靶點(diǎn)序列，成功建立起慢病毒介導(dǎo)的PTEN基因表達(dá)降低的RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系模型。

3 討論

PTEN基因又被稱為TEP1（TGF-regulated and epithelial cell-enriched phosphatase）和MMAC1（mu?tated in multiple advanced cancer 1），編碼由403個(gè)氨基酸組成的具有雙重磷酸酶活性的蛋白質(zhì)，可通過(guò)拮抗酪氨酸激酶等抑制腫瘤發(fā)生，是一種研究廣泛的抑癌基因。MAPK信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)控PTEN基因的關(guān)鍵通路[20]，此外，Wnt、NF-κB等通路也能受到PTEN基因的影響，在各種生理病理過(guò)程中起到作用[21]。PTEN基因?qū)?xì)胞功能影響較大，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的細(xì)胞周期，并通過(guò)調(diào)控細(xì)胞遷移及凋亡影響細(xì)胞壽命，進(jìn)而發(fā)揮抑癌功能[22]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因在腦缺血[23]、纖維化[24]、銀屑病[25]等疾病中也起到作用，可以說(shuō)參與了臨床上多個(gè)科室多種疾病的過(guò)程，也因此受到研究者的重視。

圖3 MOI為10時(shí)PTEN-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染RSC96施萬(wàn)細(xì)胞（200×）

圖4 MOI為5時(shí)PTEN-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染RSC96施萬(wàn)細(xì)胞（200×）

圖5 PTEN基因mRNA的表達(dá)情況

在骨科領(lǐng)域，PTEN基因也發(fā)揮了重要作用。Huang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，小分子RNA Mir-26a-5p可以通過(guò)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的作用影響纖維細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡，進(jìn)行調(diào)控類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展；Zhang等[27]則認(rèn)為，小分子RNA Mir-130a可以通過(guò)上述通路調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖，減輕骨關(guān)節(jié)炎的病情。Lugo等[28]應(yīng)用PTEN基因條件性敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，小鼠大腦中PTEN基因敲除后，骨骼骨質(zhì)疏松，更容易發(fā)生骨折。Li等[29]則發(fā)現(xiàn)，MYB因子誘導(dǎo)下上調(diào)小分子RNAMir-363-3p后，可以在PTEN基因相關(guān)通路的影響下調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松癥的過(guò)程。此外，PTEN基因在大鼠周圍神經(jīng)發(fā)育及損傷修復(fù)中起到重要作用[30]，參與了急性脊髓損傷中軸突生長(zhǎng)和功能的恢復(fù)[31]。由此可知，PTEN基因可以作為臨床上治療各種骨科疾病的潛在靶點(diǎn)。

RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系是一種在骨科領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的細(xì)胞[32]，尤其是創(chuàng)傷骨科、脊柱外科、手外科領(lǐng)域。在一般的細(xì)胞研究中，所用的細(xì)胞量是較多的，使用原代施萬(wàn)細(xì)胞需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)周期，限制了研究的進(jìn)展，而應(yīng)用RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系則可以彌補(bǔ)這些不足，該細(xì)胞不僅保留了原代施萬(wàn)細(xì)胞的特征，還能夠進(jìn)行多次傳代，培養(yǎng)條件也比原代施萬(wàn)細(xì)胞簡(jiǎn)單[33]。我們通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，敲減PTEN基因的RSC96施萬(wàn)細(xì)胞模型鮮有報(bào)道，因此設(shè)計(jì)了本研究，建立PTEN基因表達(dá)降低的RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系模型。

病毒作為基因轉(zhuǎn)染中的一種工具，具有良好的特性，其可以將自身攜帶的目的基因整合到宿主細(xì)胞的DNA分子上，從而使重組的DNA分子可以隨細(xì)胞分裂而穩(wěn)定地遺傳下去，在細(xì)胞系中形成一種穩(wěn)轉(zhuǎn)株。目前常用的病毒載體主要有三種：慢病毒、腺病毒和重組腺相關(guān)病毒[34]。本研究使用的是慢病毒，該病毒是在人類免疫缺陷I型病毒（human immunode?ficiency virus-1，HIV-1）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種單鏈RNA病毒，可插入最大約10 kb的外源基因片段。慢病毒既可以轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞，也可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞，對(duì)原代培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率也較高，有較好的優(yōu)勢(shì)。本課題組在前期研究中，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染建立了SIRT1基因表達(dá)降低的ATDC5細(xì)胞模型[35]，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)ATDC5細(xì)胞中SIRT1基因表達(dá)降低可以通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路造成該細(xì)胞退變[36]。Liu等[37]應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將骨肉瘤細(xì)胞中BTF3基因沉默，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。也有研究者將慢病毒介導(dǎo)的microRNA-26a轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞造成細(xì)胞中小分子RNA過(guò)表達(dá)，將其用于小鼠顱骨缺損修復(fù)，取得了良好的效果[38]。由此可知，慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在骨科領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

我們?cè)谘芯恐性O(shè)計(jì)了大鼠PTEN基因的RNAi特異性序列，并用吉?jiǎng)P基因的GV248載體將其連接，成功構(gòu)建了PTEN-RNAi框架，并將其包裝成慢病毒后感染RSC96施萬(wàn)細(xì)胞，感染后的細(xì)胞狀態(tài)良好，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組相比，PTEN-RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染后，RSC96施萬(wàn)細(xì)胞中PTEN基因的表達(dá)量明顯降低，敲減效率達(dá)76.78%。建立該細(xì)胞模型后，我們可以在其基礎(chǔ)上對(duì)周圍神經(jīng)損傷后效應(yīng)器與中樞相互作用的重塑過(guò)程進(jìn)行深入研究，或者探討干預(yù)分子靶點(diǎn)促進(jìn)脊髓損傷后的修復(fù)進(jìn)程的可能性，為進(jìn)一步了解PTEN基因在這些過(guò)程中的作用及可能機(jī)制做鋪墊，從而最終為臨床治療相關(guān)疾病尋找新的分子靶點(diǎn)。

本研究也有不足之處，首先，采用的RSC96細(xì)胞為細(xì)胞系，這與原代細(xì)胞有所區(qū)別，細(xì)胞系雖能多次傳代，但與來(lái)源于生物體本身的原代細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂情況不同，所得的研究結(jié)果需要進(jìn)一步分析或在原代細(xì)胞、動(dòng)物層面進(jìn)行驗(yàn)證后才能得到更加準(zhǔn)確的結(jié)論。其次，缺少在此細(xì)胞模型上的深入機(jī)制研究，當(dāng)然這也為我們進(jìn)一步的研究?jī)?nèi)容提供了方向。

綜上所述，本研究成功設(shè)計(jì)出一條可用于PTEN基因干擾的RNAi序列，并包裝成滴度及轉(zhuǎn)染效率均較高的慢病毒，將其轉(zhuǎn)染RSC96施萬(wàn)細(xì)胞后，成功構(gòu)建了PTEN基因表達(dá)降低的RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系模型，為我們團(tuán)隊(duì)及其他研究者應(yīng)用細(xì)胞模型研究PTEN基因敲減在骨科疾病發(fā)生發(fā)展中的功能及通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)疾病修復(fù)的實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。