尹 娟， 王瑩超， 眭 陽， 江 春， 時蘊琦， 朱超望

（1.南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院消化系疾病與營養(yǎng)研究中心，江蘇 蘇州 215008；2. 南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院檢驗科，江蘇 蘇州 215008）

近年來，隨著碳青霉烯類藥物在臨床的廣泛應用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）給臨床抗感染治療帶來很大困擾。攜帶碳青霉烯酶基因是CRE的主要耐藥機制，這些耐藥基因存在于可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上，可以在不同菌株間水平傳播 。為了及時、有效地治療CRE感染，臨床實驗室必須具備快速、準確的鑒定能力。2009年，美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦改良Hodge試驗（modified Hodge test，MHT）作為腸桿菌科細菌碳青霉烯酶表型篩查的常規(guī)方法；2017年，CLSI推薦改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem inactivation method，mCIM）作為腸桿菌科細菌碳青霉烯酶表型篩查方法；2018年，CLSI推薦采用mCIM和乙二胺四乙酸碳青霉烯滅活試驗（ethylene diamine tetraacetic acid-carbapenem inactivation method，eCIM）[1]進行腸桿菌科細菌碳青霉烯酶表型篩查。mCIM用于檢測腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶；eCIM與mCIM聯(lián)合使用，用于區(qū)分產(chǎn)金屬酶和絲氨酸碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌。本研究擬比較MHT和mCIM、eCIM在篩查腸桿菌科細菌碳青霉烯酶表型中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2017—2018年南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院分離自臨床樣本的亞胺培南和美羅培南耐藥腸桿菌科細菌117株（實驗組），包括肺炎克雷伯菌83株、大腸埃希菌13 株、產(chǎn)氣腸桿菌9株、陰溝腸桿菌5株、產(chǎn)酸克雷伯菌4株、科澤枸櫞酸桿菌2株和弗勞地枸櫞酸桿菌1株。另收集同期南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院碳青霉烯類敏感腸桿菌科細菌臨床分離株50株為對照組。所有菌株均采用Phoenix 100全自動細菌鑒定儀及配套革蘭陰性檢測板進行細菌鑒定和體外藥物敏感性試驗，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）進行確認。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）購自我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑

Phoenix 100全自動細菌鑒定儀（美國BD公司），Arktik PCR擴增儀（美國Thermo公司），ProXima凝膠成像儀（荷蘭ISOGEN公司），Bruker Microflex LT/SH質(zhì)譜儀（德國Bruker公司），聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）反應試劑盒（日本Takara公司），美羅培南和亞胺培南藥物敏感性試驗紙片（英國Oxoid公司），血瓊脂平板和MH平板（鄭州安圖生物有限公司）。

1.3 碳青霉烯酶基因檢測

采用煮沸法制備DNA模板，PCR擴增引物及反應條件參照文獻[2-3]，引物信息見表1。PCR擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳及測序確認。

表1 碳青霉烯酶基因引物信息

1.4 產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌表型篩查

1.4.1 MHT 用0.9%氯化鈉溶液配制0.5麥氏濁度大腸埃希菌（ATCC 25922）菌液，1∶10稀釋，用棉簽涂布于MH平板，在MH平板中心貼亞胺培南紙片，挑取孵育過夜的測試菌株，從紙片邊緣向外劃直線，35 ℃孵育16～20 h后判讀結(jié)果。觀察靠近待測菌株處的大腸埃希菌生長有無增強，如有增強則判為陽性。

1.4.2 mCIM和eCIM 取2管2 mL TSB肉湯，1管為mCIM試驗管，1管加入20 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液用于eCIM試驗（EDTA終濃度為5 mmol/L）。用1 μL接種環(huán)刮取滿環(huán)血瓊脂平板上過夜培養(yǎng)的受試菌菌株，分別加入上述2管TSB肉湯中，將美羅培南紙片浸入菌懸液，35 ℃溫育4 h。制備0.5麥氏濁度大腸埃希菌（ATCC 25922）菌懸液，并均勻涂布MH平板，用10 μL接種環(huán)將美羅培南紙片取出貼至MH平板，同一受試菌mCIM和eCIM試驗管中的美羅培南紙片貼于同一MH平板，35 ℃溫育20 h，測量抑菌圈直徑。結(jié)果判斷：（1）mCIM試驗，若美羅培南抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm，但抑菌圈內(nèi)有散在菌落，則結(jié)果陽性，即產(chǎn)碳青霉烯酶；（2）eCIM試驗，當mCIM結(jié)果為陽性時，若2張紙片抑菌圈直徑之差≥5 mm，則判為陽性，即產(chǎn)金屬酶。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。敏感性比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯類耐藥基因檢測結(jié)果

117株CRE中，有108株檢出碳青霉烯類耐藥基因，其中91株攜帶blaKPC-2、8株攜帶blaNDM-1、6株攜帶blaNDM-5、2株攜帶blaIMP-4、1株同時攜帶blaKPC-2和blaIMP-4基因。50株碳青霉烯類敏感腸桿菌科細菌均未檢出碳青霉烯耐藥基因。見圖1。

圖1 部分碳青霉烯類耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳分析

2.2 MHT、mCIM、eCIM表型篩查

108株攜帶碳青霉烯酶基因的CRE中，MHT陽性94株，敏感性為87%；陰性14株，均攜帶blaNDM基因；mCIM均為陽性，敏感性為100%，顯著高于MHT（χ2=14.97，P＜0.01）。14株攜帶blaNDM基因的菌株eCIM顯示陽性，2株攜帶blaIMP基因的菌株在EDTA濃度為5、10、20 mmol/L時eCIM均顯示為陰性；1株同時攜帶blaKPC和blaIMP基因的菌株，eCIM為陰性；eCIM敏感性為82.4%（14/17）。50株碳青霉烯類敏感腸桿菌科細菌MHT 、mCIM和eCIM均為陰性。見圖2、表2。

圖2 部分MHT、mCIM和eCIM結(jié)果

表2 MHT、mCIM、eCIM碳青霉烯酶表型篩查結(jié)果 株

3 討論

CRE感染是一個全球性的健康問題，快速、準確地檢測CRE對于預防和控制其傳播至關(guān)重要。MHT操作簡單、不需特殊試劑及儀器，目前已被臨床微生物實驗室廣泛采用。MHT對大多數(shù)碳青霉烯酶，特別是KPC酶的敏感性是可以接受的，但對產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的敏感性較低[4-6]，在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或頭孢菌素酶與孔蛋白缺失的分離株中會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，而在產(chǎn)NDM酶的菌株中會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)MHT檢測NDM酶的敏感性為50%[4]，本研究產(chǎn)NDM酶的14株腸桿菌科細菌MHT均為陰性，不同臨床實驗室采用MHT檢測NDM酶的敏感性的差異可能與判讀標準有關(guān)。

由于MHT在檢測上的局限性，2018年CLSI推薦mCIM聯(lián)合eCIM作為新的碳青霉烯酶表型篩查方法[1]。mCIM操作簡單，結(jié)果易解釋，而且不受菌齡、藥物敏感性試驗紙片以及細菌是否產(chǎn)生黏液的影響[7]，在大多臨床實驗室都可以開展，比MHT有更高的敏感性和特異性[8]。本研究結(jié)果顯示，MHT的敏感性為87.0%，mCIM的敏感性為100.0%，2種方法的特異性均為100.0%。

eCIM是輔助mCIM用于區(qū)分腸桿菌科細菌產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶還是產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶，可指導臨床用藥。新研制的內(nèi)酰胺-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合（頭孢他啶-阿維巴坦和美羅培南-法硼巴坦）以及其他正在開發(fā)的藥物（亞胺培南/西拉他丁-瑞來巴坦）對大多數(shù)產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶菌株都有效，但對產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶菌株無效[9]。

eCIM檢測腸桿菌科細菌的敏感性＞95%[1]，但本研究2株產(chǎn)IMP酶的菌株（1株肺炎克雷伯菌、1株產(chǎn)酸克雷伯菌）eCIM出現(xiàn)假陰性，EDTA終濃度調(diào)整到20 mmol/L仍為陰性結(jié)果。但有研究結(jié)果顯示，在EDTA終濃度為0.1 mmol/L時，攜帶IMP酶的腸桿菌科細菌eCIM顯示陰性，EDTA終濃度為5 mmol/L時，eCIM則為陽性[10]。本研究中出現(xiàn)假陰性結(jié)果的原因有待進一步研究。

與其他表型篩查方法一樣，eCIM不能區(qū)分同時含有絲氨酸酶和金屬酶菌株中的這2種酶。本研究中1株同時攜帶KPC和IMP的肺炎克雷伯菌，mCIM陽性，但eCIM陰性。

本研究涉及的菌株數(shù)量有限，只檢測到3類碳青霉烯酶，其中主要為KPC和NDM。我國腸桿菌科碳青霉烯酶主要為KPC和NDM[11]，其他包括IPM、VIM和OXA-48在腸桿菌科臨床分離株中較為少見[12]。本研究mCIM和eCIM檢測KPC和NDM的敏感性和特異性均達到100.0%。

綜上所述，采用mCIM篩查碳青霉烯酶比MHT更加敏感和特異，與eCIM聯(lián)合使用可以區(qū)分絲氨酸酶和金屬酶，可有效協(xié)助臨床治療CRE感染。