曾佩佩， 曾 婷， 鄧梁瓊， 郭 浩， 馮玉山， 黃麗萍， 李紅輝

（1.柳州市婦幼保健院，廣西 柳州 545001；2.北京量化健康科技有限公司，北京 100070）

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）屬于廣泛性發(fā)育障礙中的一個(gè)類型，主要表現(xiàn)為社會(huì)交往障礙、言語(yǔ)和非言語(yǔ)交流障礙、刻板行為和狹隘興趣三大主要臨床癥狀[1]。近年來(lái)，ASD患病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。BAIO等[2]的研究結(jié)果顯示，美國(guó)8歲兒童中每59人就有1人患有ASD，男女患病比例為4∶1。我國(guó)尚無(wú)大樣本流行病學(xué)報(bào)道。目前，ASD的干預(yù)方法以行為治療為主，無(wú)法達(dá)到滿意的康復(fù)效果。ASD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，近年來(lái)隨著對(duì)腸道微生物研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腸-腦-微生態(tài)軸的紊亂可能與ASD的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系[3]。本研究擬采用高通量測(cè)序分析ASD患兒糞便樣本的腸道菌群分布，以期為ASD患兒的腸道微生態(tài)研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年2—3月柳州市婦幼保健院兒童保健科確診為ASD的患兒35例（ASD組），其中男28例、女7例，年齡（3.11±0.83）歲。選取同期柳州市婦幼保健院體檢健康兒童35名（正常對(duì)照組），其中男21名、女14名，年齡（3.37±1.24）歲。2個(gè)組之間年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)柳州市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有對(duì)象的家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

ASD患兒均符合美國(guó)精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第5版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders -fifth edition，DSM-Ⅴ）規(guī)定的ASD診斷標(biāo)準(zhǔn)。年齡2～6歲，性別不限。排除患有重大疾病者，如糖尿病、結(jié)腸炎、痢疾、肝硬化等。近1個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)抗菌藥物、激素類藥物以及注射過(guò)病毒類疫苗，未服用益生菌及益生元補(bǔ)充品。自愿參加本研究，且家屬簽署知情同意書(shū)。

1.3 方法

1.3.1 糞便標(biāo)本采集 糞便標(biāo)本采集采取立取、立存（取樣后立即保存）原則，用專用無(wú)菌糞便采集盒留取糞便，排便之前排空小便，防止樣本接觸尿液，影響檢測(cè)結(jié)果。取樣前洗手，戴無(wú)菌手套、口罩，用取便管深入糞便，采集約2 g糞便置于樣本保護(hù)液中保存。樣本采集后，標(biāo)記好姓名、標(biāo)號(hào)、采樣日期等以備檢查。所有對(duì)象均需完整、詳細(xì)填寫(xiě)基本信息調(diào)查表，經(jīng)核對(duì)準(zhǔn)確無(wú)誤后建立完整資料數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.2 樣本DNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 對(duì)所有糞便樣本進(jìn)行DNA提取并構(gòu)建文庫(kù)。采用nova seq 6000測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）及配套試劑進(jìn)行測(cè)序，得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)。所有樣本均進(jìn)行生物信息數(shù)據(jù)分析，得出腸道菌群信息，并確定菌群特征。

1.3.3 生物信息數(shù)據(jù)分析 原始宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)采用MOCAT2軟件進(jìn)行質(zhì)量控制[4]。高質(zhì)量的reads用SOAPdenovo v2.04軟件（參數(shù)：all-D 1-M 3-L 500）進(jìn)行從頭組裝，基于組裝獲得scaftigs，用MetaGeneMark軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[5]，預(yù)測(cè)后的基因用CD-HIT聚類算法進(jìn)行聚類去冗余[6]，構(gòu)建基因長(zhǎng)度＞100 bp的非冗余基因集。采用DIAMON軟件將獲得的非冗余參考基因集與京都基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（Carbohydrate-active enzymes database，CAZy）比對(duì)，對(duì)預(yù)測(cè)出的基因進(jìn)行功能注釋。在基因?qū)用嫔希瑢⒏哔|(zhì)量的reads通過(guò)BWA軟件與構(gòu)建的非冗余基因集進(jìn)行對(duì)比，去除長(zhǎng)度＜30 bp及一致性＜95%的reads，得到每個(gè)基因的reads計(jì)數(shù)，再經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理獲得基因的相對(duì)豐度。在菌群上進(jìn)行樣本內(nèi)多樣性分析，用Shannon指數(shù)表示樣本的alpha多樣性，Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。用基于bray-curtis 距離的主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）在二維坐標(biāo)上顯示不同樣本之間的相似性及差異性。采用相似百分比方法確定造成菌群群落差異的主要細(xì)菌種類[7]。用PERMANOVA分析[8]檢驗(yàn)分組對(duì)樣本菌群差異的影響。通過(guò)Wilcoxon檢驗(yàn)比較組間菌群相對(duì)豐度的差異，以確定有顯著差異的單元。采用Lefse分析尋找在各分類層級(jí)上差異顯著的單元。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

35例ASD患兒和35名正常對(duì)照者測(cè)序后共得到408.3 G原始測(cè)序數(shù)據(jù)，樣本的reads為23 494 234～69 105 708，平均為41 748 599。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制后再進(jìn)行從頭組裝、基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、聚類去冗余，最終獲得非冗余基因集。2個(gè)組之間基因的韋恩圖和box圖見(jiàn)圖1。韋恩圖提示ASD組與正常對(duì)照組糞便樣本中基因表達(dá)存在差異。box圖顯示2個(gè)組糞便樣本基因的集中性均較好，無(wú)明顯異常值。ASD組糞便樣本基因表達(dá)較正常對(duì)照組更集中。

圖1 ASD組與正常對(duì)照組糞便樣本中基因表達(dá)的韋恩圖和box圖

2.2 菌群組成分析

對(duì)所有研究對(duì)象的腸道菌群從物種到門(mén)水平各個(gè)層級(jí)進(jìn)行分析，獲得相對(duì)豐度。結(jié)果顯示，ASD組和正常對(duì)照組的腸道菌群共包含16個(gè)門(mén)159個(gè)屬，其中糖酵母菌門(mén)2個(gè)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01），但其在腸道菌群結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度很低；厚壁菌門(mén)在所有菌群中占最主要地位，所有研究對(duì)象的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)依次為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)，2個(gè)組之間優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)豐度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ASD組與正常對(duì)照組之間罕見(jiàn)小球菌屬、霍爾德曼菌屬、Candidatus Saccharibacteria noname屬、普雷沃菌屬、Burkholderiales noname屬、戈登桿菌屬、另枝菌屬、Solobacterium屬、Parasutterella屬、Anaerotruncus屬、桿菌屬、叢毛單胞菌屬、孿生球菌屬、顆粒球菌屬相對(duì)豐度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但除另枝菌屬外，其他菌屬相對(duì)豐度都很低。相對(duì)豐度居前8位的分別為擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、Blautia屬、另枝菌屬、梭菌屬及瘤胃球菌屬。ASD組與正常對(duì)照組之間僅Alistipes屬相對(duì)豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022）（ASD組占6.34%，正常對(duì)照組占2.44%），其他7個(gè)菌屬2個(gè)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,見(jiàn)表1。ASD組與正常對(duì)照組各菌門(mén)和菌屬的相對(duì)豐度比例見(jiàn)圖2。ASD組與正常對(duì)照組菌群多樣性分析的Shannon指數(shù)見(jiàn)圖3。基于菌群計(jì)算的樣本距離PCoA結(jié)果顯示，主坐標(biāo)成分為12.5%，即樣本菌群存在差異，見(jiàn)圖4。造成菌群差異的主要細(xì)菌種類前20位分別為長(zhǎng)雙歧桿菌、直腸真桿菌、Faecalibacterium prausnitzii、脆弱擬桿菌、糞普雷沃菌、普通擬桿菌、短雙歧桿菌、單形擬桿菌、Alistipes putredinis、Faecalibacterium prausnitzii、居糞擬桿菌、Ruminococcus bromii、多形擬桿菌、橢圓形擬桿菌、假小鏈雙歧桿菌、活潑瘤胃球菌、Clostridium nexile、鼠乳桿菌、Eubacterium eligens及糞擬桿菌。Permanova檢驗(yàn)結(jié)果顯示分組對(duì)樣本菌群差異無(wú)影響（P=0.178），見(jiàn)圖5。

圖2 不同分組在菌門(mén)和菌屬水平的相對(duì)豐度組成

圖3 ASD組與正常對(duì)照組菌群多樣性的比較

圖4 基于菌群計(jì)算的樣本距離PCoA結(jié)果

圖5 Permanova檢驗(yàn)結(jié)果

2.3 菌群差異分析

組間菌群相對(duì)豐度的差異分析結(jié)果顯示，ASD組翁德頓氏另枝菌、Alistipes putredinis、芬戈?duì)柕率蠑M桿菌、謝氏另枝菌、前庭鏈球菌、絲狀霍爾德曼菌、芽胞擬桿菌、伯克霍爾德菌-1-1-47、單形巨單胞菌、Gordonibacter pamelaeae、糞副擬桿菌、生黃瘤胃球菌、毛螺科菌_3_1_57FAA_CT1、Parasutterella excrementihominis的相對(duì)豐度明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），而毗鄰顆粒鏈球菌、死亡梭桿菌、莫氏細(xì)小桿菌、直腸真桿菌、Candidate division_TM7_single_cell_isolate_TM7c及麻疹孿生球菌相對(duì)豐度低于正常對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 ASD組與健康對(duì)照組之間前20位菌群相對(duì)豐度差異比較

Lefse分析結(jié)果顯示，ASD組與正常對(duì)照組菌群在各分類層級(jí)上均存在有顯著差異的單元，其中ASD組糞便樣本中顯著存在的是普雷沃菌科、理研菌科、Burkholderiales noname科及叢毛單胞菌科，而正常對(duì)照組糞便樣本中顯著存在的是肉桿菌科、梭菌科、氨基酸球菌科及伯克氏菌科。見(jiàn)圖6。

圖6 Lefse分析結(jié)果

2.5 菌群差異功能分析

針對(duì)基于基因加和而成的KEGG和CAZy功能層面的read count豐度，分析ASD組與正常對(duì)照組的差異。ASD組與正常對(duì)照組注釋到KEGG層面及CAZy層面的基因相對(duì)豐度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。差異居前20位的基因的身份識(shí)別號(hào)（identity document，ID）見(jiàn)表3、表4。

表3 ASD組與正常對(duì)照組注釋到KEGG層面的基因豐度差異居前20位基因的ID

表4 ASD組與正常對(duì)照組注釋到CAZy層面的基因豐度差異居前20位基因的ID

3 討論

腸道菌群是人體腸道的正常微生物，定居于腸道黏膜表面，能產(chǎn)生名為N-?；０返男⌒陀袡C(jī)復(fù)合物，可與受體相互作用，調(diào)節(jié)人體生理健康，參與包括免疫、行為和代謝等各個(gè)方面的信號(hào)傳導(dǎo)[9]。腸道菌群與宿主相互影響的體系統(tǒng)稱為腸道微生態(tài)，是人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過(guò)神經(jīng)、內(nèi)分泌免疫及代謝途徑影響中樞神經(jīng)及腸道系統(tǒng)，這種相互作用即為腸-腦軸-微生態(tài)[10]。腸道微生物菌群對(duì)人類兒童階段的生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用[11]。近期有研究結(jié)果顯示，ASD的發(fā)病與腸道菌群的紊亂相關(guān)[12-13]，ASD患者的腸道菌群構(gòu)成與健康人群存在差異。CORETTI等[14]采用16SrRNA測(cè)序并擴(kuò)增16SrRNA（V3～V4）基因標(biāo)記對(duì)2～4歲ASD患兒及同年齡健康兒童腸道菌群進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，ASD患兒擬桿菌門(mén)和變形桿菌門(mén)明顯增多，放線菌門(mén)明顯減少。STRATI等[15]通過(guò)焦磷酸測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)ASD患者中厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值顯著升高，在屬水平上，ASD組另枝菌屬、嗜膽菌屬、小桿菌屬、副擬桿菌屬和韋榮球菌屬的相對(duì)豐度下降，而柯林斯氏菌、棒狀桿菌、Dorea和乳酸菌的相對(duì)豐度明顯上升。MARíNEZ-GONZáLEZ等[16]通過(guò)回顧性分析發(fā)現(xiàn)，ASD患兒念珠菌、普雷沃菌、鏈球菌和細(xì)孔菌的豐度高于有便秘癥狀的兒童（P＜0.05），二者之間擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、杜氏菌門(mén)、乳酸菌門(mén)、Prausnitzii、糞桿菌門(mén)及擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)比值有明顯差異。ZHANG等[17]采用16SrRNA測(cè)序并擴(kuò)增16SrRNA（V3～V4）基因標(biāo)記對(duì)35例ASD患兒的腸道菌群進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，在門(mén)水平上，ASD組擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)比值顯著升高；在屬水平上，ASD組薩特菌屬、Odoribacter屬和Butyricimonas屬的基因相對(duì)豐度顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05），而韋榮球菌屬和鏈球菌屬的基因相對(duì)豐度顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。MA等[18]對(duì)45例ASD患兒與45名健康兒童的糞便樣本進(jìn)行16SrRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，ASD患兒腸道菌群在門(mén)水平上的微生物群相對(duì)豐度與健康兒童相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在其他層面上，ASD患兒與健康兒童相比，氨基酸球菌科相對(duì)豐度較低，Lachnoclostridium屬、Tyzzerella亞群4、Flavonifractor屬和Lachnospiraceae屬的相對(duì)豐度降低[18]。目前，ASD患者腸道菌群失調(diào)已被證實(shí)，但不同的患者微生物群改變并不一致，而且常常相互矛盾，并沒(méi)有一個(gè)獨(dú)特的微生物群組成[19]。

在菌門(mén)水平上，健康人群腸道菌群中存在厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)及擬桿菌門(mén)，這些細(xì)菌在腸道內(nèi)形成一定的比例，從而控制著腸道菌群的平衡，這種關(guān)系可以直接反映宿主本身的健康狀況。本研究結(jié)果顯示，ASD患兒腸道菌群中存在4種優(yōu)勢(shì)菌門(mén)——厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)及放線菌門(mén)，與正常對(duì)照者比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究結(jié)果與國(guó)外研究結(jié)果[14，16]存在差異，與國(guó)內(nèi)部分研究結(jié)果[18]一致，這可能與地域差異、飲食結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，ASD組與正常對(duì)照組糖酵母菌門(mén)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01），但其在腸道菌群結(jié)構(gòu)中的相對(duì)豐度很低。目前，對(duì)人腸道系統(tǒng)中糖酵母菌門(mén)的研究較少，其主要被發(fā)現(xiàn)存在于活性污泥中，用于處理工業(yè)污水[20]。因此，糖酵母菌門(mén)是否與ASD發(fā)病機(jī)制相關(guān)仍需進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示，在菌屬水平上，ASD組與正常對(duì)照組有14種菌屬存在差異，其中相對(duì)豐度較高的另枝菌屬在文獻(xiàn)[15]中有過(guò)報(bào)道，其余13種菌屬相對(duì)豐度均很低，在既往的研究中鮮有報(bào)道，因此其與ASD的相關(guān)性尚需進(jìn)一步深入研究。另枝菌屬屬于理研菌科，是革蘭陰性厭氧菌，為兼性致病菌。有研究結(jié)果顯示，抑郁癥患者腸道系統(tǒng)中另枝菌屬增多[21-22]，可能是導(dǎo)致抑郁癥的主要原因之一[23]。另枝菌屬可影響色氨酸的利用，破壞腸道系統(tǒng)中5-羥色胺的平衡，進(jìn)而抑制大腦活動(dòng)，這可能是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)障礙的原因之一[24]，但其與ASD的相關(guān)性仍有待進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

本研究菌群差異分析結(jié)果顯示，ASD組翁德頓氏另枝菌、Alistipes putredinis、芬戈?duì)柕率蠑M桿菌、謝氏另枝菌、前庭鏈球菌、絲狀霍爾德曼菌、芽胞擬桿菌、伯克霍爾德菌-1-1-47、單形巨單胞菌、糞副擬桿菌、生黃瘤胃球菌、毛螺科菌_3_1_57FAA_CT1及Parasutterella excrementihominis的相對(duì)豐度均高于正常對(duì)照組（P＜0.05），而毗鄰顆粒鏈球菌、死亡梭桿菌、莫氏細(xì)小桿菌、直腸真桿菌、Candidate division_TM7_single_cell_isolate_TM7c及麻疹孿生球菌相對(duì)豐度均低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。Lefse分析結(jié)果顯示，ASD組糞便樣本中顯著存在的是普雷沃菌科、理研菌科、Burkholderiales noname科及叢毛單胞菌科，正常對(duì)照組糞便樣本中顯著存在的是肉桿菌科、梭菌科、氨基酸球菌科及伯克氏菌科。進(jìn)一步利用KEGG及CAZy對(duì)差異菌群功能進(jìn)行注釋，結(jié)果顯示注釋到的基因相對(duì)豐度在ASD組與正常對(duì)照組之間存在明顯差異，提示碳水化合物活性酶可能參與了ASD的發(fā)病過(guò)程。

綜上所述，ASD患兒腸道存在微生態(tài)失調(diào)，與既往研究結(jié)果[14-18]一致，但檢出的細(xì)菌種類與既往研究結(jié)果[14-18]存在差異，進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示ASD患兒并沒(méi)有一個(gè)特定的腸道微生物群組成[19]。本研究檢測(cè)出的細(xì)菌有可能是ASD發(fā)生、發(fā)展的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。但本研究尚存在一定的局限性：納入樣本量不足，研究對(duì)象年齡集中在2～6歲，且探討的是我國(guó)兒童的腸道菌群情況，與國(guó)外研究相比，研究對(duì)象的生活環(huán)境不同、飲食結(jié)構(gòu)有一定的差異，因此對(duì)研究結(jié)果有一定影響。今后將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行更大范圍的研究，為ASD患兒腸道微生態(tài)研究提供更充分的依據(jù)。