諶 飛， 覃再隆， 陳少科， 范 歆， 李 川， 易 賞， 沈亦平， 羅靜思

（1.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院遺傳代謝中心實驗室，廣西 南寧 530002；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院內(nèi)分泌遺傳病專科，廣西 南寧 530002）

PRKAR1A基因主要指導(dǎo)蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）調(diào)節(jié)亞單位的合成，是PKA四聚體（2個調(diào)節(jié)亞單位、2個催化亞單位）的關(guān)鍵組成部分之一。PRKAR1A蛋白具有抑制/激活PKA活化的重要功能，參與調(diào)節(jié)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝以及調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[1]。PRKAR1A基因由1個N端調(diào)節(jié)性二聚化/對接結(jié)構(gòu)域、1個包含抑制位點的連接接頭和2個cAMP結(jié)合域共同構(gòu)成。PRKAR1A蛋白本身是一個無活性復(fù)合體，與cAMP分子結(jié)合后引起可逆的空間構(gòu)象變化，從而激活PKA并釋放出活性催化亞基，是cAMP信號傳導(dǎo)的主要介導(dǎo)方式[2]。PRKAR1A基因變異通常導(dǎo)致以黏液瘤、色素沉著和內(nèi)分泌功能亢進三聯(lián)征為典型特征的卡尼復(fù)合征，臨床上常需要與McCune-Albright綜合征和庫欣綜合征鑒別[3]。關(guān)于卡尼復(fù)合征在心胸外科、皮膚科和腫瘤外科等領(lǐng)域的研究已有大量報道[4-5]，但關(guān)于PRKAR1A基因變異導(dǎo)致肢端發(fā)育不全1型的病例我國罕見報道。肢端發(fā)育不全1型是一種以身材矮小、嚴(yán)重短指畸形、面中部發(fā)育不良和甲狀腺功能異常為主要特征的骨骼發(fā)育不良疾病，其他常見的臨床表現(xiàn)還包括骨齡提前、肥胖癥以及涉及甲狀旁腺激素、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、降鈣素、生長激素釋放激素和促性腺激素的多激素抵抗等[6-7]。本研究擬通過分析PRKAR1A基因突變導(dǎo)致的肢端發(fā)育不全1型患兒的實驗室指標(biāo)與疾病表型，旨在為肢端發(fā)育不全1型的鑒別診斷和早期干預(yù)提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年3月—2019年12月廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院確診為肢端發(fā)育不全1型的患兒4例，其中男2例、女2例，年齡1～12歲。本研究經(jīng)廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護人均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集及測序

收集4例患兒的臨床資料（性別、就診年齡、出生情況、身高、體質(zhì)量、頭圍、面部畸形、牙齒、短指畸形、智力發(fā)育）及實驗室檢測結(jié)果[TSH、生長激素（growth hormone，GH）、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（insulin-like growth factor-binding protein 3，IGFBP-3）、促卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxine，T4）、血鉛（plumbum，Pb）、血鎘（cadmium，Cd）、總鈣（calcium，Ca）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、尿常規(guī)]。

采集4例患兒及其父母的靜脈全血3 mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，采用Lab-Aid 820核酸自動化提取儀（廈門致善公司）及配套試劑提取基因組DNA。采用Qubit 4.0熒光定量儀（美國Thermo Fisher公司）檢測提取的DNA濃度。采用SureSelect人類全外顯子靶向序列捕獲系統(tǒng)V5試劑盒（美國安捷倫公司）構(gòu)建基因組DNA的測序文庫，采用HiSeq2500測序系統(tǒng)（美國Illumina公司）進行高通量測序分析。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析及基因變異位點解讀

采用基因組分析工具（the genome analysis toolkit，GATK）[8]對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析。采用TGex高通量測序數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（美國TGex公司）對變異位點進行注釋和篩選，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會制定的《遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》[9]進行變異位點的解讀與分析，結(jié)合患兒臨床表型和致病性預(yù)測軟件數(shù)據(jù)，確定變異的致病性等級。對于判斷為致病性、可能致病性及臨床意義不明的變異位點，使用PRKAR1A基因的NM_002734. 4轉(zhuǎn)錄本，采用Sanger測序法對患兒及其家庭成員進行變異位點的二次驗證。

2 結(jié)果

2.1 4例肢端發(fā)育不全1型患兒的臨床資料

4名患兒均為足月順產(chǎn)，無家族史，具有相同的典型臨床特征，具體表現(xiàn)為：（1）嚴(yán)重的勻稱性身材矮小[低于同年齡、同性別、同地區(qū)平均兒童身高3～6個標(biāo)準(zhǔn)差（-3s～-6s）]、低體質(zhì)量[低于同年齡、同性別、同地區(qū)平均兒童體質(zhì)量2～4個標(biāo)準(zhǔn)差（-2s～-4s）]；（2）短肢畸形，手指短而彎曲，指骨、掌骨發(fā)育不全，見圖1；（3）面中部發(fā)育不良，前額突出、眼距寬、長人中、鼻梁塌陷、短球狀鼻及小下頜，見圖2；（4）甲狀腺功能異常，F(xiàn)T3、FT4正常，TSH升高。4例患兒的一般臨床資料及實驗室檢測結(jié)果見表1、表2。

表1 4例肢端發(fā)育不全1型患兒的一般臨床資料

表2 4例肢端發(fā)育不全1型患兒實驗室檢測結(jié)果

除以上的共同臨床表現(xiàn)之外，不同病例還有各自不同的表現(xiàn)。

病例1：自幼喂養(yǎng)飲食均正常，5歲時發(fā)現(xiàn)生長發(fā)育明顯落后，現(xiàn)青春發(fā)育延遲，骨齡落后；左手正位數(shù)字化攝影提示左手各掌骨及指骨粗短，干骺端增寬，邊緣不規(guī)則呈喇叭狀，骨骺骨小、不規(guī)則，呈錐狀被包埋，部分干骺愈合；關(guān)節(jié)間隙清晰，關(guān)節(jié)對位關(guān)系可，骨齡落后，見圖3（a）。

病例2：除面部及手部影像特征[圖1（a）、圖2（a）]外，垂體磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查提示脫髓鞘病變[圖4（a）]。

病例3：除面部及手部影像特征[圖1（b）、圖2（b）]外，母親孕期染色體芯片檢查未見異常，5個月會抬頭，獨坐獨走時間不詳，2歲會說話，提示運動及語言發(fā)育遲緩。

圖1 肢端發(fā)育不全1型患兒手部特征

圖2 肢端發(fā)育不全1型患兒面部特征

病例4：骨齡相符，但左手正位數(shù)字化攝影提示明顯的肢端骨骼發(fā)育異常，見圖3（b）；垂體MRI未見明顯異常，垂體高5.6 mm，腦部雙側(cè)卵圓中心多發(fā)異常信號，考慮局灶性脫髓鞘病變可能，見圖4（b）。

圖3 肢端發(fā)育不全1型患兒左手正位數(shù)字化攝影特征

圖4 肢端發(fā)育不全1型患兒垂體MRI特征

2.2 全外顯子高通量測序結(jié)果

全外顯子高通量測序結(jié)果顯示，病例1、病例2和病例3均攜帶PRKAR1A突變（c.1102C＞T/p.Arg368*），病例4攜帶PRKAR1A突變（c.1118A＞G/p.Tyr373Cys）。上述突變在人群數(shù)據(jù)庫[the Exome Aggregation Consortium（ExAC）、Genome Aggregation Database（GnomAD）]中均未見報道，在致病數(shù)據(jù)庫（PubMed、ClinVar）中均檢索到相似癥狀的病例報道。經(jīng)先證者及其父母的Sanger測序二次驗證，確認(rèn)上述突變均為新發(fā)突變。根據(jù)《遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》，上述突變均被確定為致病性變異。

2.3 文獻已報道的PRKAR1A基因變異種類分析

本研究整理、分析了ClinVar數(shù)據(jù)庫和各類文獻報道中明確臨床診斷的PRKAR1A變異共計49種，其中引起肢端發(fā)育不全1型的12種變異主要分布于結(jié)合區(qū)域（以cAMP結(jié)合區(qū)為突變熱點區(qū)域），包括錯義突變11種、無效突變1種；引起卡尼復(fù)合征的37種變異則廣泛分布于調(diào)節(jié)區(qū)域和結(jié)合區(qū)域（以調(diào)節(jié)性二聚體為突變熱點區(qū)域），包括錯義突變8種、無效突變29種，見圖5。

圖5 PRKAR1A基因突變基因組位置分布圖

3 討論

本研究統(tǒng)計了2016年3月—2019年12月廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院兒科門診246例因身材矮小就診的患兒的全外顯子高通量測序數(shù)據(jù)，檢出4例由PRKAR1A變異導(dǎo)致的肢端發(fā)育不全1型患兒，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重身材矮小、低體質(zhì)量、短指、特殊面容及不同程度的激素異常等，與目前我國報道的1例肢端發(fā)育不全1型患兒的癥狀類似[10]。國外報道的同一變異位點患兒，多數(shù)合并隱睪和肥胖的表現(xiàn)[11-13]，但本研究的2例男性患兒并不具有隱睪、肥胖的臨床表現(xiàn)，所有患兒均表現(xiàn)為嚴(yán)重的低體質(zhì)量和生長發(fā)育遲緩。以往報道的患兒均有骨齡超前，可能與其肥胖導(dǎo)致早熟相關(guān)。但本研究4例患兒中，2例患兒表現(xiàn)為骨齡落后。此外，本研究首次揭示PRKAR1A變異患兒存在生長激素部分缺乏，這對患兒的身高改善及生長激素治療是否有指導(dǎo)意義有待進一步研究，不同種族及個體間臨床癥狀存在差異的原因也有待深入研究。本研究整理出PRKAR1A突變患兒的實驗室指標(biāo)與疾病表型，旨在完善我國肢端發(fā)育不全1型患兒的遺傳病診療數(shù)據(jù)，為臨床診斷和個體化用藥提供理論數(shù)據(jù)支持。

PRKAR1A基因具備基因多效性，其導(dǎo)致的肢端發(fā)育不全1型與卡尼復(fù)合征在臨床表現(xiàn)上顯著不同。PRKAR1A基因同一密碼子的不同堿基改變所致的不同氨基酸改變也會導(dǎo)致不同的臨床表型。如c.637G＞A/p.A213T和c.865G＞T/p.G289W會導(dǎo)致以骨骼發(fā)育不良為主要表現(xiàn)形式的肢端發(fā)育不全1型，而c.638C＞A/p.A213D和c.866G＞A/p.G289E會導(dǎo)致以多發(fā)性黏液瘤和皮膚黏膜色素性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)形式的卡尼復(fù)合征[12]?？釓?fù)合征的致病突變機制為功能缺失。ELLI等[13]的研究結(jié)果顯示，卡尼復(fù)合征患兒的PRKAR1A突變體蛋白在表達后會迅速降解，且不與PKA的催化亞基相互作用。PKA原本需要PRKAR1A蛋白結(jié)合cAMP才能改變空間構(gòu)象，從而激活并釋放催化亞基。而無義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）使PRKAR1A蛋白失去調(diào)控抑制作用，從而在無需cAMP的情況下增加PKA活性，最終導(dǎo)致類似于庫欣綜合征的臨床表現(xiàn)。肢端發(fā)育不全1型的致病機制與卡尼復(fù)合征完全不同，其突變體蛋白并不會像卡尼復(fù)合征患兒的PRKAR1A突變體蛋白一樣迅速降解，缺陷的突變體蛋白降低了PKA調(diào)節(jié)性亞基對cAMP的親和力，提升了cAMP活化PKA的濃度閾值，最終導(dǎo)致以多激素抵抗和骨骼發(fā)育不良為主要癥狀的肢端發(fā)育不全1型。RHAYEM等[12]和LE STUNFF等[14]采用PRKAR1A相同氨基酸的不同錯義突變導(dǎo)致的卡尼復(fù)合征患兒和肢端發(fā)育不全1型患兒構(gòu)建過表達細(xì)胞系，研究基因突變對PRKAR1A蛋白的影響，并在活細(xì)胞中利用生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移檢測PRKAR1A突變體蛋白與催化亞基的相互作用，證實cAMP結(jié)合缺陷導(dǎo)致PKA激活抗性是肢端發(fā)育不全1型常見的分子機制。

綜上所述，根據(jù)本研究4例PRKAR1A基因突變導(dǎo)致肢端發(fā)育不全1型患兒的臨床資料，相同基因同一密碼子的不同堿基突變可導(dǎo)致不同的臨床癥狀，說明明確患兒的遺傳背景才能有針對性地進行對癥治療和預(yù)后管理，這也為臨床工作中類似病例的診療提供了參考。