盧亞亞， 丁 宇， 姚如恩， 王依柔，張倩文， 李 群， 王 劍， 王秀敏， 婁 丹

（1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，河南 洛陽 471000；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌代謝科，上海 200127；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心分子診斷實(shí)驗(yàn)室，上海 200127）

興奮性氨基酸受體是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能。谷氨酸（glutamic acid，Glu）在所有興奮性氨基酸遞質(zhì)中含量最為豐富。Glu受體分為離子型和代謝型。離子型 Glu受體分為N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體和非NMDA受體[1]。NMDA受體是Glu受體的主要亞型，是由不同亞基構(gòu)成的異四聚體，有3種亞基[NR1、NR2（NR2A-2D）、NR3（NR3A、NR3B）][2]。NMDA受體主要參與學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性、興奮性神經(jīng)毒性等生理病理過程。GRIN1基因編碼NMDA受體的NR1亞基。NR1亞基是基本功能亞單位，如缺失會嚴(yán)重影響NMDA受體的功能[3]。GRIN1基因變異可引起癲癇性腦病、精神發(fā)育遲緩、語言落后、肌張力減退、運(yùn)動障礙、腦萎縮。該基因變異非常罕見。本研究對2例GRIN1基因新發(fā)突變患兒的臨床表型及分子特征進(jìn)行分析，探討GRIN1基因突變在兒童發(fā)育遲緩中的價值。

1 材料和方法

1.1 病例介紹

病例1，女，1歲，以“發(fā)育遲緩數(shù)月”為主要癥狀就診?；純合档?胎第2產(chǎn)，足月自然分娩出生，出生時無窒息搶救史，出生體質(zhì)量3.0 kg。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院的新生兒臨床檢查未發(fā)現(xiàn)異常。4月齡時，因不會抬頭至當(dāng)?shù)蒯t(yī)院進(jìn)行檢查，體檢發(fā)現(xiàn)患兒無追視，不會對人微笑，雙下肢肌張力低，膝腱反射正常。實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：肝、腎功能正常，血氨及乳酸正常，肌酸激酶及其同工酶正常，血常規(guī)、尿常規(guī)、糞便常規(guī)、血糖、血電解質(zhì)、25-羥基維生素D3均無異常，串聯(lián)質(zhì)譜檢查所有氨基酸和酰基肉堿譜均無明顯異常。頭顱磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查正常。擬診斷：發(fā)育落后。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院給予綜合康復(fù)及對癥支持治療，癥狀無改善?；純?2月齡時至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌醫(yī)學(xué)遺傳聯(lián)合門診就診。體格檢查：身高76 cm，體質(zhì)量9 kg，頭圍44 cm，無特殊面容，對人和物無反應(yīng)，抬頭不穩(wěn)，不會獨(dú)坐，不會翻身，無咿呀作語，心、肺聽診無異常，右耳聽力檢查欠佳，視力正常。頭顱MRI檢查未見異常。染色體核型、肝功能、堿性磷酸酶、葡萄糖、乳酸、電解質(zhì)和尿液分析均正常。血氨、乳酸、血清游離鈣檢測結(jié)果及血液串聯(lián)質(zhì)譜分析均正常。

病例2，男，7歲4個月，以“發(fā)現(xiàn)身材矮小數(shù)年并發(fā)育遲緩”為主要癥狀就診。患兒系第1胎第1產(chǎn)，足月自然分娩出生，出生時無窒息搶救史，出生體質(zhì)量3.3 kg，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院新生兒臨床檢查無異常，逐漸出現(xiàn)發(fā)育落后，伴生長速率減慢，具體不詳。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：血常規(guī)、尿常規(guī)、糞常規(guī)、肝功能、腎功能、血氨、乳酸、肌酸激酶及其同工酶、血糖、血電解質(zhì)無異常，串聯(lián)質(zhì)譜檢查所有氨基酸和?；鈮A譜均無明顯異常，頭顱MRI平掃正常。擬診斷：發(fā)育落后、矮小癥。給予對癥支持治療，癥狀改善緩慢，發(fā)育仍明顯落后于正常同齡兒童?；純?歲4個月時至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌醫(yī)學(xué)遺傳聯(lián)合門診就診。體格檢查：身高116 cm，體質(zhì)量18.4 kg，頭圍49 cm，對人和物有反應(yīng)，行走自如，會單腳跳，簡單詞匯，不能連成句，心、肺聽診無異常，四肢活動可，視力正常，聽力正常。頭顱MRI檢查未發(fā)現(xiàn)異常。染色體核型、肝功能、堿性磷酸酶、葡萄糖、乳酸、電解質(zhì)和尿常規(guī)檢測均正常。甲狀腺功能正常，胰島素樣生長因子1（insulinlike growth factor 1，IGF-1）99.4 ng/mL（降低），胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-3（insulinlike growth factor-binding protein 3，IGFBP-3）3.96 μg/mL（降低），血氨、乳酸、血清游離鈣檢測結(jié)果均正常。

本研究經(jīng)上海交通大學(xué)附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會審查批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 方法

采集2例患兒及父母外周血，用Lab-Aid DNA分離試劑盒（廈門致善生物科技股份有限公司）抽取DNA，使用Qubit 2.0 熒光計（美國Life Technologies公司）測定DNA濃度，-20 ℃保存。采用SureSelect靶序列富集試劑盒（美國Agilent公司）制備接頭連接的文庫，采用包含2 742個基因的XT Inherited Disease panel（美國Agilent公司）制備并獲得捕獲文庫，通過IlluminacBot工作站（美國Illumina公司）的等溫橋式擴(kuò)增產(chǎn)生DNA簇，最后用HiSeq 2500系統(tǒng)（美國Illumina公司）進(jìn)行靶向基因測序（targeted gene sequencing，TGS）。目標(biāo)區(qū)域平均測序深度為135×，20×以上區(qū)域?yàn)?8.85%。測序數(shù)據(jù)經(jīng)Sequence Control軟件（美國Illumina公司）評估，合格后采用NextGENe軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，然后采用Variant Analysis軟件（美國Ingenuity Systems公司）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。選擇腦發(fā)育異常的臨床癥狀作為篩選候選變異的指標(biāo)。對篩查出的基因進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 2例發(fā)育遲緩患兒基因檢測結(jié)果

病例1：GRIN1基因存在“錯義變異c.1672T＞G，p.Phe558Val（雜合）”，患兒父母親該位點(diǎn)為正?；蛐?。該變異為新發(fā)現(xiàn)的變異，經(jīng)Alamut功能軟件（瑞士SOPHiA GENETICS公司）預(yù)測可能會影響蛋白結(jié)構(gòu)域的功能。按美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomic，ACMG）變異分類標(biāo)準(zhǔn)，歸類為“可能致病性”變異。見圖1。

病例2：GRIN1基因存在“錯義變異c.1852G＞A，p.Gly618Ser（雜合）”?；純焊改赣H該位點(diǎn)為正?；蛐?。該變異為新發(fā)現(xiàn)的變異，經(jīng)Alamut功能軟件預(yù)測可能會影響蛋白結(jié)構(gòu)域的功能。按照ACMG變異分類標(biāo)準(zhǔn)，歸類為“可能致病性”變異。見圖1。

圖1 2例發(fā)育遲緩患兒及其父母GRIN1基因序列

2.2 臨床隨訪

病例1隨訪至2歲，期間排除其他器官、系統(tǒng)畸形，行心臟、腹部超聲等均未見異常。行康復(fù)治療，全身肌張力低下，運(yùn)動發(fā)育遲緩，不能獨(dú)坐，可伸手取遠(yuǎn)處物品，有眼神交流，不會說話。身高、體質(zhì)量與同年齡兒童相仿。

病例2隨訪至8歲，身高增長至119 cm，智力發(fā)育無明顯改善，明顯落后于正常同齡兒童。

2.3 文獻(xiàn)報道的GRIN1基因突變類型和患兒臨床表現(xiàn)分析

對本研究的2例及文獻(xiàn)報道的37例GRIN1基因突變相關(guān)發(fā)育落后患兒的GRIN1基因突變類型和臨床表現(xiàn)進(jìn)行分析，具體見圖2及表1。

圖2 GRIN1基因突變區(qū)域分布

表1 GRIN1基因突變患兒的臨床表型分析

續(xù)表1

3 討論

智力障礙或全面發(fā)育遲緩是一大類具有高度臨床和遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，常共患孤獨(dú)癥譜系障礙、注意缺陷多動障礙等多種精神行為障礙，是全球兒童致殘的主要原因之一，其病因復(fù)雜，涉及遺傳和環(huán)境等多種因素[13]。近年來，隨著基因檢測技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用，一些與嬰幼兒發(fā)育遲緩相關(guān)的基因備受關(guān)注。矮小癥是指與同地區(qū)、同年齡、同性別正常兒童比較，身高位于正常兒童生長曲線的第3百分位數(shù)以下[14]。有諸多原因會影響兒童生長，導(dǎo)致兒童矮小，如遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境、精神心理因素、下丘腦-垂體-胰島素樣生長因子軸異常、染色體畸變、全身性慢性疾病、遺傳代謝病以及內(nèi)分泌因素等。矮小合并畸形或發(fā)育異常者需要警惕遺傳代謝性疾病[15]。

本研究2例GRIN1基因突變引發(fā)發(fā)育遲緩的患兒中有1例同時合并矮小癥。GRIN1基因突變引發(fā)發(fā)育遲緩極為罕見，目前僅報道30余例，尚未見合并矮小癥的報道。結(jié)合文獻(xiàn)報道，包括本研究2例患兒在內(nèi)的39例患兒的共同臨床特征為發(fā)育遲緩、認(rèn)知障礙、不同程度的智力受損等[4-12]。多數(shù)[72.2%（26/36）]患兒無自行行走能力，本研究病例1有此表現(xiàn)。部分患兒還表現(xiàn)為刻板運(yùn)動[2.6%（1/39）]和眼動障礙[12.8%（5/36）]，本研究2例患兒均無此表現(xiàn)。其他臨床表現(xiàn)還有：孤獨(dú)癥譜系障礙[20.5%（8/39）]、性格激進(jìn)[2.6%（1/39）]、自殘行為[2.6%（1/39）]、痛覺異常[2.6%（1/39）]、睡眠障礙[20.5%（8/39）]、喂養(yǎng)困難[23.1%（9/39）]、小頭畸形[2.6%（1/39）]等，其中畸形是非特異性的臨床特征[6-7]。本研究2例患兒均無以上表現(xiàn)。

GRIN1基因突變患者中大部分有癲癇史[43.6%（17/39）]。癲癇發(fā)作表現(xiàn)為多種類型，如全身性癲癇、局灶性癲癇、嬰兒痙攣、強(qiáng)直癲癇、肌陣攣性癲癇和發(fā)熱性癲癇等，癲癇發(fā)作時的年齡、腦電圖類型和抗癲癇治療效果有明顯差異[6-7，9-11]。本研究2例患兒在隨訪期內(nèi)均無癲癇發(fā)作，這與文獻(xiàn)報道（突變位點(diǎn)相近的患兒無癲癇發(fā)作）[7]一致?？紤]到GRIN1基因突變患兒癲癇初次發(fā)作的年齡有較大差異，本研究中有1例患兒年齡尚小，因此仍需長期隨訪。

N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）在正常的大腦發(fā)育和功能中起著重要作用。NMDAR亞單位的突變與多種癲癇綜合征及一些神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)。由GRIN1基因編碼的NMDAR NR1亞基包含4個結(jié)構(gòu)域：（1）細(xì)胞外氨基末端結(jié)構(gòu)域，主要調(diào)節(jié)離子通道開放和反應(yīng)時間過程；（2）ATD；（3）具有4個疏水段（M1～M4）的TMD；（4）CTD，參與定位和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]。NR1亞基的激活涉及幾個調(diào)節(jié)因素機(jī)制。NR1亞基上存在NMDAR激動劑之一的甘氨酸（glycine，Gly）結(jié)合位點(diǎn)。NR2亞基上的Glu結(jié)合位點(diǎn)通過結(jié)合Glu觸發(fā)調(diào)節(jié)向內(nèi)電流陽離子選擇孔的打開，從而導(dǎo)致神經(jīng)元去極化和細(xì)胞內(nèi)鈣離子流入增加[16]。NMDAR的激活需要激動劑Gly的輔助。NR1亞基與NR2亞基結(jié)合后才能形成具有高度活性功能的NMDA通道，調(diào)節(jié)鈣離子的內(nèi)流。NMDAR也有幾種負(fù)調(diào)節(jié)方式，包括電壓依賴型細(xì)胞外鎂離子、細(xì)胞外離子及內(nèi)源性細(xì)胞外鋅離子[1]。

本研究和文獻(xiàn)報道的39例患兒中，GRIN1基因突變復(fù)合雜合變異32例、純合變異7例?；純侯A(yù)后：有3例死亡，死亡患兒出生后即出現(xiàn)難以控制的癲癇，死亡時年齡較小，其他36例表現(xiàn)為不同程度的智力發(fā)育遲滯、運(yùn)動障礙等。

大多數(shù)GRIN1基因突變靠近或集中于構(gòu)成固有離子通道的4個TMD受體的區(qū)域（圖2）。TMD區(qū)域的突變與離子孔破裂有關(guān)，表現(xiàn)為功能失調(diào)或缺乏功能[4]。本研究病例1發(fā)現(xiàn)的新突變p.Phe558Val在連接配體結(jié)合區(qū)（ligandbinding domain，LBD）和TMD的前M1區(qū)，可能在傳遞配體信息中起作用，誘導(dǎo)LBD到TMD的結(jié)構(gòu)變化。因此，p.Phe558Val突變可能影響NMDAR的功能，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的臨床表現(xiàn)。病例2的p.Gly618Ser變異位于跨膜區(qū)，對于p.Gly618和p.Gly620位點(diǎn)的突變，有模型預(yù)測可能會影響Glu NR1亞基順利進(jìn)入對離子的選擇性通過起決定作用的通道。因此，孔殘基p.Gly618和p.Gly620轉(zhuǎn)化為帶電精氨酸側(cè)鏈可能對NMDA通道屬性有很大的影響[8]。NMDAR的NR1亞基出現(xiàn)突變，會影響神經(jīng)元去極化和細(xì)胞內(nèi)鈣離子的流入超載，導(dǎo)致相關(guān)神經(jīng)元功能損傷。

有研究結(jié)果顯示，在僅表達(dá)Glu NR1正常水平5%～10%的GRIN1突變亞型小鼠模型中，小鼠的刻板行為增加，具有R844C純和突變的GRIN1突變小鼠模型具有多動、社會互動減少、驚嚇反應(yīng)及異常的焦慮樣行為[17-18]。盡管這些小鼠模型的行為異常與本研究的雜合子患兒不完全相似，但表明GRIN1基因突變可能在2個物種的社會和認(rèn)知行為中起著相似的作用。

GRIN1突變具有相似的臨床特征。但PADEROVA等[12]報道的1例GRIN1基因突變的9歲男孩，突變位點(diǎn)為c2470A＞T，患兒有嚴(yán)重的智力發(fā)育延遲和運(yùn)動遲緩，肌張力減退、輕度小頭畸形、小指的單側(cè)畸形、短手指、手指墊突出、關(guān)節(jié)松弛，還具有特殊面容：長眼瞼、眼瞼下垂、藍(lán)鞏膜、斜視、高而窄顎弓、尖下巴、大耳、低位耳、耳廓畸形。這些臨床特征與歌舞伎綜合征類似，但缺乏歌舞伎綜合征的分子基因診斷。其他NMDAR亞單位突變也有交叉重疊的臨床表現(xiàn)，如GRIN2A基因突變與語言異常及一系列的癲癇性腦病有關(guān)。有研究結(jié)果顯示，已知基因中致病性變異的表型表達(dá)可能與不同的遺傳模式有關(guān)。目前尚未見編碼NMDAR其他亞單位（如GRIN2A）基因的純合或雙等位變異的報道[19]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了2例新的GRIN1基因突變引發(fā)的發(fā)育遲緩患兒，擴(kuò)展了該基因變異的基因型和表型庫。對于發(fā)育遲緩的患兒，排除繼發(fā)因素后，應(yīng)重視GRIN1基因突變的檢測。完善該類患兒的基因檢測，有助于明確病因，精準(zhǔn)診斷，同時也有助于患兒及其父母的遺傳咨詢，做好產(chǎn)前診斷工作。