葉遠(yuǎn)舟， 劉 凱， 王雅冰， 蘇儉生

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，上海 200072）

牙周炎是一種病因及成因復(fù)雜的感染性疾病[1]，也是最常見的口腔疾病之一。有研究顯示，2010年全球重度牙周炎的患病率高達(dá)10.8%，影響約7.43億人，是全球第六大流行疾病[2]。牙周炎的發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為是高度復(fù)雜的，由Toll樣受體識(shí)別微生物配體激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引發(fā)了牙周炎癥的產(chǎn)生[3-4]。牙周炎致病菌（革蘭氏陰性桿菌）細(xì)胞外膜上的脂多糖（LPS）可被 Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）識(shí)別，從而介導(dǎo)免疫炎癥的發(fā)生，在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[5-6]。炎癥性免疫反應(yīng)被認(rèn)為是宿主防御感染的防御機(jī)制，但炎癥性細(xì)胞因子的釋放會(huì)導(dǎo)致牙齦萎縮和牙槽骨吸收，最終可導(dǎo)致牙齒脫落，嚴(yán)重影響口腔健康[7]。長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一類內(nèi)源性長(zhǎng)度大于200 nt的轉(zhuǎn)錄本，被認(rèn)為一般不具有轉(zhuǎn)錄活性，因其在基因調(diào)控中的重要作用而成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。在免疫炎癥過(guò)程中，lncRNAs同樣發(fā)揮了重要作用[8-9]。Atianand等[10]在Cell雜志上發(fā)表了新的發(fā)現(xiàn)，lincRNA-EPS可通過(guò)控制核小體定位抑制免疫反應(yīng)基因（immune response genes，IRGs）的轉(zhuǎn)錄，從而下調(diào)IRGs的表達(dá)。而LPS的刺激可以激活TLR4下調(diào)lincRNA-EPS的表達(dá)，導(dǎo)致免疫炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)。那么lincRNA-EPS在LPS誘導(dǎo)的牙周炎癥中是否發(fā)揮作用，以及發(fā)揮了怎樣的作用，目前尚缺乏研究。本研究旨在初步探索lincRNA-EPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠牙周膜細(xì)胞（mPDLCs）炎癥因子表達(dá)的影響，并探討其與牙周炎發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能存在的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡C57BL/6雄性小鼠（同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；6～8周齡lincRNA-EPS敲除的C57BL/6雄性小鼠（上海南方模式生物科技股份有限公司合作構(gòu)建）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行，審批編號(hào)為[2018]倫審字（026）號(hào)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 大腸埃希菌來(lái)源的LPS、Ⅰ型膠原酶（Sigma-Aldrich 公司，美國(guó)）；胎牛血清，α-MEM 培養(yǎng)液（Gibco 公司，美國(guó)）；波形蛋白（Vimentin，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）；熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó)）；TRIzol試劑，Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)）；胰蛋白酶，青鏈霉素溶液（Hyclone公司，美國(guó)）；lincRNA-EPS過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，中國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；ELISA 試劑盒：cxcl10（Invitrogen 公司，美國(guó)），IL-1α、IL-6（Novus公司，美國(guó)）。

1.1.3實(shí)驗(yàn)器材 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Thermo公司，美國(guó)）；Ⅰ型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)）；體式顯微鏡、熒光倒置相差顯微鏡和照相系統(tǒng)（Zeiss公司，德國(guó)）；低溫高速離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，中國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）；紫外線分光光度儀（GE公司，美國(guó)）；熒光定量PCR儀 （Roche公司，瑞士）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek 公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1lincRNA-EPS基因敲除小鼠模型的構(gòu)建 體外轉(zhuǎn)錄合成Cas9 mRNA和gRNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將20 μL 25 ng/mL的gRNA和10 μL 100 ng/μL的Cas9 mRNA混勻,加入3 mol/L乙酸鈉3 μL，pH調(diào)至5.2，用無(wú)水乙醇沉淀后，再用無(wú)酶水重懸。通過(guò)顯微注射法將混合物注射到小鼠受精卵胞質(zhì)中,將存活的受精卵移植到假孕受體母鼠體內(nèi)，至母鼠生產(chǎn)，獲得首建鼠（F0代）。F0代小鼠PCR產(chǎn)物經(jīng)T-vector連接后測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果。

1.2.2mPDLCs分離培養(yǎng)及鑒定 將小鼠斷頸處死后，用75%乙醇浸泡5 min，隨后將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)。用仰臥位固定小鼠，打開其口腔，用止血鉗拔下完整的磨牙后，在體視顯微鏡下清除周邊多余的牙齦組織及黏附的牙槽骨。用含4%青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次，加入2 mg/mL的Ⅰ型膠原酶1 mL，經(jīng)37℃水浴搖床消化1 h后終止酶消化，用吸管反復(fù)吹打數(shù)次，消化液經(jīng)200目細(xì)胞篩過(guò)濾，濾液經(jīng)300×g離心5 min后，棄上清液，保留細(xì)胞沉淀物。加入含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，48 h后更換新鮮完全培養(yǎng)液，之后每3 d換液2次。當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%后，以1∶2的比例傳代至第3代時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。一抗選擇Vimentin，二抗選擇熒光（Cy3）標(biāo)記羊抗兔IgG熒光，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞類型。

1.2.3納米粒材料制備及牙周膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 在課題組前期研究中，已成功使用2，2′-二硫二乙醇對(duì)硝基苯基碳酸酯和含有叔胺的二伯胺類化合物 1，4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪,通過(guò)縮聚反應(yīng)制備出含有雙硫鍵的陽(yáng)離子型聚氨酯 [2，2′-dithiodiethanol bis （p-nitrophenyl carbonate） and 1，4-bis（3-aminopropyl） piperazine，BAP]，且已證明這是一種基因傳遞的、安全高效的非病毒載體[11]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇BAP搭載lincRNA-EPS過(guò)表達(dá)質(zhì)粒形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。提前1 d將mPDLCs置于6孔板中鋪板，鋪板密度為2.5×105個(gè)/孔，混勻，貼壁培養(yǎng)。24 h后細(xì)胞融合至60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取100 μL的Opti-MEM培養(yǎng)液，加入1.5 mL無(wú)菌EP管中，然后加入1 μg相應(yīng)質(zhì)粒,混勻后加入BAP，再次混勻后室溫靜置20 min。將質(zhì)粒混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4mPDLCs轉(zhuǎn)染及LPS誘導(dǎo) 共設(shè)5個(gè)實(shí)驗(yàn)組：野生型對(duì)照組（WT組）、野生型刺激組（WT+LPS組）、敲除型對(duì)照組（KO組）、敲除型刺激組（KO+LPS組）及挽救實(shí)驗(yàn)組（KO+LPS+lincRNA-EPS組）。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的前1 d，將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于含有適量完全培養(yǎng)液的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在WT+LPS組、KO+LPS組及KO+LPS+lincRNA-EPS組中加入100 ng/mL的LPS溶液，刺激6 h。KO+LPS+lincRNA-EPS組提前使用BAP搭載lincRNA-EPS過(guò)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。WT組及KO組不做處理。

1.2.5RNA提取和RT-qPCR的使用 用TRIzol試劑提取待測(cè)孔板中實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RNA的濃度及純度后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。根據(jù)RT-qPCR的試劑盒說(shuō)明書配制相應(yīng)的反應(yīng)體系，設(shè)定RT-qPCR 的循環(huán)條件：①95℃，30 s；②95℃，5 s；③60℃，30 s；步驟②和③重復(fù)40個(gè)循環(huán)。測(cè)定的炎癥相關(guān)基因?yàn)?cxcl10、cxcl12、cxcl14、IL-1α 及 IL-6，以 GAPDH為內(nèi)參對(duì)照。各引物序列見表1。

1.2.6ELISA測(cè)定相關(guān)細(xì)胞因子 將各組待測(cè)孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管，在4℃下以1500r/min離心10 min，立即分裝上清液并在-80℃下保存樣本，待用。使用 ELISA 試劑盒（cxcl10、IL-1α、IL-6），按照說(shuō)明書要求進(jìn)行檢測(cè)，所有通過(guò)ELISA進(jìn)行細(xì)胞因子分析的實(shí)驗(yàn)均按照一式三份進(jìn)行。操作步驟：①以捕獲抗體質(zhì)量濃度為1～10 μg/mL的碳酸氫鹽緩沖液包被微量滴定板的孔，在4℃下過(guò)夜；②封閉后加入100 μL稀釋樣品；③加檢測(cè)抗體后室溫下孵育2 h；④添加偶聯(lián)二抗置室溫下孵育1～2 h；⑤加底物液，終止反應(yīng)后進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判定和分析。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件包對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)后使用，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的方式表示。采用單因素方差分析比較組間差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 炎癥因子基因引物序列Table 1 Primer sequences of inflammatory cytokines

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建lincRNA-EPS基因敲除小鼠模型

體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA和gRNA電泳結(jié)果見圖1，得到gRNA目的條帶與設(shè)計(jì)的gRNA一致,表明mRNA和gRNA載體構(gòu)建成功。F0代小鼠PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序比對(duì)（表2），確認(rèn)獲得2只目的基因缺失的陽(yáng)性F0代小鼠。通過(guò)后續(xù)繁殖獲得的純合型目的基因缺失子代，經(jīng)基因鑒定后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 成功分離培養(yǎng)mPDLCs

免疫熒光結(jié)果（圖2）顯示，Vimentin陽(yáng)性率＞90%，即細(xì)胞純度＞90%。結(jié)果說(shuō)明成功分離培養(yǎng)了mPDLCs。

2.3 轉(zhuǎn)染效率測(cè)定

BAP搭載lincRNA-EPS過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染mPDLCs，轉(zhuǎn)染效率接近20%（圖3），具有良好的轉(zhuǎn)染效果，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

2.4 lincRNA-EPS敲除對(duì)牙周膜細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果如圖4所示，KO組各炎癥因子mRNA的表達(dá)量較低，與WT組相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05）；LPS刺激 6 h后，KO+LPS組相比 KO 組，以及WT+LPS組相比WT組，炎癥因子的表達(dá)均上調(diào)（P<0.05），且KO+LPS組表達(dá)水平相較于WT+LPS組更高（P<0.05）；而挽救實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于KO+LPS組，各個(gè)炎癥因子的mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05）。

2.5 lincRNA-EPS敲除對(duì)牙周膜細(xì)胞炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

ELISA結(jié)果如圖5所示，KO+LPS組相比WT+LPS組，cxcl10、IL-1α的蛋白表達(dá)水平更高 （P<0.05），而 IL-6 無(wú)差異（P>0.05）；挽救實(shí)驗(yàn)組與 KO+LPS 組比較，其 cxcl10、IL-1α、IL-6 的蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P<0.05）。

圖1 體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA和gRNA的電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoresis of Cas9 mRNA and gRNA in vitro

表2 F0代小鼠PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果Table 2 Sequencing results of F0 generation mouse PCR products

圖2 mPDLCs免疫熒光鑒定（×400）Figure 2 Immunofluorescence identification of mPDLCs（×400）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BAP轉(zhuǎn)染效率Figure 3 Transfection efficiency of BAP detected by flow cytometry

3 討論

牙周炎是口腔常見的一種慢性感染性疾病，嚴(yán)重影響口腔健康甚至影響全身健康。LPS作為牙周炎主要致病菌（革蘭氏陰性桿菌）的毒力因子，不僅能直接作用于牙周組織細(xì)胞，引起牙周組織的破壞，同時(shí)也是一種潛在的細(xì)胞激活因子，可促進(jìn)牙周組織的炎癥反應(yīng)和骨吸收，在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用[6,12]。TLR4作為L(zhǎng)PS的受體，是Toll樣受體家族成員之一，在引發(fā)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟分化及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等方面起重要作用[13-14]。當(dāng)TLR4成功識(shí)別LPS后，首先會(huì)引起一系列接頭蛋白的招募，進(jìn)一步可以向下傳遞級(jí)聯(lián)信號(hào)，最終通過(guò)磷酸化作用，使轉(zhuǎn)錄因子活化并進(jìn)入細(xì)胞核，從而激活包括促炎性細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α 等）和趨化性細(xì)胞因子（IL-8）在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的表達(dá)?？梢姡乐苎椎陌l(fā)展與LPS介導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)是密切相關(guān)的。

圖4 各組mPDLCs炎癥因子mRNA的表達(dá)水平Figure 4 mRNA expression level of inflammatory cytokines in mPDLCs

圖5 各組mPDLCs炎癥因子蛋白的表達(dá)水平Figure 5 Protein expression level of inflammatory cytokines in mPDLCs

LncRNAs可通過(guò)介導(dǎo)染色體重塑、組蛋白修飾、X染色體失活，以及基因組印跡、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、降解和轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑，在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等層面上調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響疾病的發(fā)生和發(fā)展[15-16]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs不僅在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，而且還是調(diào)控免疫功能的關(guān)鍵因子[17]。而牙周炎也是免疫系統(tǒng)功能異常引發(fā)骨組織破壞的疾病之一。Zou等[18]通過(guò)基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，相較于鄰近正常組織，慢性牙周炎組織中表現(xiàn)出明顯的lncRNAs差異性表達(dá)，提示lncRNAs可能在牙周炎的發(fā)病和發(fā)展過(guò)程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，lincRNA-EPS能精確調(diào)控IRGs的表達(dá)，lincRNA-EPS定位于IRGs調(diào)控區(qū)，可控制核小體定位并抑制IRGs轉(zhuǎn)錄，lincRNA-EPS缺乏小鼠在受到LPS刺激后，心臟、肝臟、脾臟、腎臟組織均表現(xiàn)出明顯的炎癥反應(yīng)，而引入外源性lincRNAEPS后，炎癥反應(yīng)明顯減輕[10]。另外，有研究表明，牙周組織先天性免疫系統(tǒng)是口腔抵抗外來(lái)侵害的一道屏障，而該過(guò)程是依賴于相關(guān)受體識(shí)別微生物或炎癥信號(hào)后引起的轉(zhuǎn)錄變化，通過(guò)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給下游的轉(zhuǎn)錄因子后誘導(dǎo)成千上萬(wàn)的免疫IRGs表達(dá)，進(jìn)而引起免疫反應(yīng)[19]。而由LPS誘導(dǎo)的牙周炎，是否也受到lincRNA-EPS的調(diào)控，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從功能缺失和功能獲得2個(gè)方向研究lincRNA-EPS在LPS誘導(dǎo)的mPDLCs中的調(diào)控作用。CRISPR/Cas9是一種高效、快速、便捷、廉價(jià)的基因編輯工具，可靶向敲除基因[20]。此技術(shù)已成熟應(yīng)用于lncRNA基因敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)能成功構(gòu)建lincRNAEPS基因敲除的C57BL/6J小鼠。研究已證明，IL-6、IL-1α在慢性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起作用[22]。且有研究證明，cxcl家族在介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的牙周炎中起重要作用，cxcl10在牙周炎患者中的表達(dá)顯著增加，可視為一種生物標(biāo)志物[23-24]。本研究中，我們應(yīng)用RT-qPCR和ELISA技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組牙周膜細(xì)胞IL-6、IL-1α、cxcl10的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各炎癥因子在WT組和KO組中表達(dá)量較低，2組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果無(wú)顯著差異。這表明，在無(wú)LPS刺激的正常狀態(tài)下，lincRNA-EPS的缺失不會(huì)直接導(dǎo)致牙周膜細(xì)胞炎癥因子基礎(chǔ)表達(dá)量的增高。WT+LPS組和KO+LPS組與各自的對(duì)照組相比，其IL-6、IL-1α、cxcl10的表達(dá)明顯增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明LPS刺激成功誘導(dǎo)了mPDLCs炎癥因子的表達(dá)上調(diào)。而KO+LPS組相較于WT+LPS組，各炎癥因子的表達(dá)量更高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明lincRNA-EPS缺失的mPDLCs在LPS誘導(dǎo)下會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的炎癥因子表達(dá)，而lincRNA-EPS的正常表達(dá)則可在一定程度上抑制炎癥因子的表達(dá)。目前，基因治療被認(rèn)為是牙周炎的一種替代療法，當(dāng)前的基因遞送方法在轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染效率方面顯示出可靠、一致的結(jié)果[25]。目前，已有研究將納米顆粒載體應(yīng)用于牙周膜細(xì)胞的基因遞送[26-27]。在課題組的前期研究中已成功合成BAP，且證明其具有良好的轉(zhuǎn)染效果。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇BAP作為質(zhì)粒載體。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，BAP搭載lincRNA-EPS過(guò)表達(dá)質(zhì)粒形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物具有較好的轉(zhuǎn)染效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)BAP搭載lincRNA-EPS過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染mPDLCs，構(gòu)建了挽救實(shí)驗(yàn)組，挽救實(shí)驗(yàn)組相較于KO+LPS組，各炎癥因子表達(dá)量明顯下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明外源性lincRNA-EPS的引入有效抑制了炎癥因子的表達(dá)，也證明以lincRNA-EPS為靶向基因的基因治療存在一定的可行性。

綜上所述，牙周膜細(xì)胞中l(wèi)incRNA-EPS的缺失，可導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而通過(guò)引入外源性lincRNA-EPS的方法則有效抑制了炎癥因子的表達(dá)，表明lincRNAEPS可能在LPS誘導(dǎo)的牙周炎癥中起到負(fù)向調(diào)控作用。本研究初步驗(yàn)證了lincRNA-EPS在LPS誘導(dǎo)性牙周炎中可能起到重要的負(fù)向調(diào)控作用，并為探究lincRNA-EPS與牙周炎之間的關(guān)系及可能的相應(yīng)基因治療，奠定了初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。