劉 懋，唐苗寧，管佳妮，謝理哲，吳 斌，顧敏芬，嚴(yán) 斌

牙周膜是連接牙根與牙槽骨的致密結(jié)締組織，厚度為0.15～0.38 mm，具有承載和傳導(dǎo)力、調(diào)節(jié)和緩沖咀嚼壓力的作用。牙周膜的組成成分包含膠原纖維、非彈性纖維、基質(zhì)、細(xì)胞等[1]，其中，膠原纖維包括多種分型，以Ⅰ型膠原含量最多，占牙周膜的78.06%[2]，主要由膠原蛋白構(gòu)成，能夠抵抗?fàn)坷ΑＱ乐苣ぴ谡Υ碳は碌纳锪W(xué)響應(yīng)，對牙槽骨的改建起調(diào)控作用。牙周膜中膠原蛋白的合成與降解，在正畸牙移動(dòng)過程中起著重要作用[3]。

Ⅰ型膠原纖維構(gòu)成了牙周膜的主體，其主要成分為膠原蛋白。膠原蛋白是結(jié)締組織中的一種結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)，具有多樣的分子構(gòu)象，膠原分子的有序排列使膠原纖維具有一定的強(qiáng)度和韌性[4]。以往對于牙周膜膠原的生物力學(xué)研究，主要集中于力刺激對膠原蛋白表達(dá)的影響， Xu等[5]在大鼠正畸牙移動(dòng)模型中，通過免疫組化染色和Western blot的方法發(fā)現(xiàn)牙周膜張力側(cè)Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)上調(diào)。Komatsu等[6]探究了膠原的機(jī)械性破壞對力學(xué)響應(yīng)的影響，通過使用Ⅲ型膠原酶處理大鼠牙周膜，觀察到牙周膜纖維的形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中最大剪切力減小。KarisAllen等[7]發(fā)現(xiàn)高溫會(huì)使膠原蛋白受到機(jī)械性損傷，破壞纖維交聯(lián)，從而出現(xiàn)膠原纖維密度改變。然而，現(xiàn)有的研究主要以膠原含量的表征為主，而膠原蛋白本身復(fù)雜的空間構(gòu)象對蛋白質(zhì)功能有重要作用[8]，目前，在分子水平上，牙周膜膠原蛋白的空間結(jié)構(gòu)改變?nèi)绾斡绊懷乐苣ぬ匦匀晕幢魂U明。

近年來，拉曼光譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料的檢測[9]，具有對多種功能基團(tuán)敏感、高特異性、無損的特點(diǎn)。在口腔黏膜病、牙周炎、口腔癌的診斷上也開展了臨床研究[10]，通過檢測組織樣本的分子結(jié)構(gòu)改變，為早期診斷口腔疾病提供了可能。但是，由于牙周膜材料尺寸較小，并且難以完整獲取，故以往拉曼光譜較少應(yīng)用于牙周膜研究[11]。共聚焦顯微拉曼光譜結(jié)合激光共聚焦顯微鏡，提高了檢測精確度，同時(shí)不受樣本保濕條件的影響，故適用于研究微小的牙周膜膠原改性的結(jié)構(gòu)變化。

本文以人牙周膜樣本為研究對象，針對牙周膜中含量最豐富的Ⅰ型膠原，通過Ⅰ型膠原酶處理模擬膠原降解，進(jìn)行顯微拉曼光譜檢測，分析牙周膜膠原改性后膠原蛋白結(jié)構(gòu)的變化，為深入研究牙周膜的生物力學(xué)特性提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器

健康人上頜骨1個(gè)[南京醫(yī)科大學(xué)倫審(2019)324號]。Ⅰ型膠原酶(Sigma，美國)。

低速切割機(jī)(500 r/s,IsoMet，Buehler，美國)，金剛石刀片(φ100 mm×φ12.7 mm×0.4 mm,科晶，中國)。激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(LabRAM HR Evolution，HORIBA，法國)。

拉曼光譜分析軟件Labspec(version 6，HORIBA，法國)；光譜分峰擬合軟件Peakfit(version 4.12，Seasolve，美國);圖表繪制分析軟件Origin(version 2018, origin-lab，美國)。

1.2 樣本制備

將人上頜骨頰腭側(cè)黏膜組織剝離，利用手工鋸分離獲得包括2顆上頜前磨牙的塊狀牙齒組織。使用低速切割機(jī)將切下的塊狀樣本沿垂直于牙齒長軸的方向自牙槽嵴頂至根尖段，切割成2 mm厚的薄片各3片。

每一薄片再使用低速切割機(jī)進(jìn)行樣本的制備。使用金剛石刀片垂直于牙薄片，沿牙中心部位將樣本分割為4條均包含“牙齒-牙周膜-牙槽骨”的三明治長條狀樣本(圖1A)。將制備好的樣本放入裝有生理鹽水溶液的試管中并置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 樣本分組

選取牙根中部的樣本，將同一牙位的近中、遠(yuǎn)中兩條長條樣本隨機(jī)劃分進(jìn)膠原酶處理組和對照組，每組包含3個(gè)樣本。

1.4 膠原酶處理

Ⅰ型膠原酶溶液配制：將Ⅰ型膠原酶溶解于緩沖液，制成10 mg/mL[12]的膠原酶溶液。

將酶處理組的牙周膜樣本放入37 ℃水浴鍋化凍，PBS沖洗樣本后，置入Ⅰ型膠原酶溶液浸泡2 h，取出樣本，置入PBS溶液浸泡3次，每次10 min。最后將樣本放回含生理鹽水試管中-20 ℃保存。

1.5 拉曼光譜檢測

實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將處理組和對照組的樣本均提前化凍，6個(gè)樣本依次使用激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(圖1B)進(jìn)行檢測。參考Perillo[11]的方法設(shè)定參數(shù)，儀器的激發(fā)波長為633 nm，放大倍數(shù)50倍，積分時(shí)間為30 s，光譜范圍200～2 000 cm-1，累計(jì)3次。

A：牙周膜樣本 B：拉曼光譜儀

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)獲得人牙周膜樣本拉曼光譜曲線，通過拉曼光譜分析軟件Labspec 6 進(jìn)行基線校正，用Peakfit軟件(v4.12)對樣本光譜酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶進(jìn)行高斯擬合，得到圖譜的特征峰強(qiáng)度和峰面積，求得膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)各組分的相對百分比含量，使用圖像繪制軟件Origin (2018版本)進(jìn)行曲線圖繪制。

2 結(jié) 果

2.1 牙周膜拉曼光譜曲線

如圖2所示，牙周膜的拉曼光譜特征峰主要包括： 853 cm-1處的酪氨酸，935 cm-1處的C—C伸縮振動(dòng)，1 005 cm-1處的苯丙氨酸，1 459 cm-1處的CH2， 1 200～1 350 cm-1的酰胺Ⅲ帶，1 600～1 700 cm-1的酰胺Ⅰ帶。膠原酶處理組和對照組的牙周膜的顯微拉曼光譜圖展現(xiàn)在圖2中,主鏈的酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶的譜峰強(qiáng)度在膠原酶處理組和對照組不同，表明蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖2 Ⅰ型膠原酶處理組和對照組的牙周膜樣本顯微拉曼光譜Fig.2 Micro-Raman spectra of periodontal ligament samples in control group and collagenase Ⅰ treatment group

2.2 酰胺Ⅲ帶的高斯擬合圖譜分析

對各組牙周膜樣本的拉曼圖譜在1 200～1 350 cm-1范圍的酰胺Ⅲ帶進(jìn)行分峰,得到子峰的譜線，并進(jìn)行高斯擬合(圖3)。圖中表明，在正常組牙周膜樣本中，酰胺Ⅲ帶可見4根譜線，分別在1 239 cm-1(β-折疊)，1 252 cm-1(無規(guī)卷曲),1 272 cm-1(α-螺旋),1 289 cm-1(β-回折)。在膠原酶處理后，4根譜線的峰高均減小，峰位出現(xiàn)了偏移(表1)，分別對應(yīng)α-螺旋、β-折疊、β-回折結(jié)構(gòu)發(fā)生了向右的紅移，無規(guī)卷曲發(fā)生了向左的紫移。

根據(jù)特征峰位使用Peakfit軟件進(jìn)行高斯擬合，獲得各子峰的峰面積，以各峰面積占總面積的百分比值作為各二級結(jié)構(gòu)的相對含量(表2)。正常牙周膜中，酰胺Ⅲ帶各二級結(jié)構(gòu)的含量如表2所示，α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對含量最大，占61%，其余結(jié)構(gòu)的相對含量由大到小依次為：無規(guī)卷曲、β-折疊，β-回折。通過膠原酶的降解，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量降低，由61%下降到9%，無規(guī)卷曲和β-折疊、β-回折的相對含量增加，可能是膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化[13]。

A：酶處理組；B：對照組

表1 膠原酶處理組和對照組膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)光譜帶歸屬Tab.1 Spectral band assignment of collagen secondary structure in control group and collagenase Ⅰ treatment group

2.3 酰胺Ⅰ帶的高斯擬合圖譜分析

圖2表明，牙周膜膠原蛋白酰胺Ⅰ帶分布在1 600～1 700 cm-1范圍，進(jìn)行分峰得到4根二級結(jié)構(gòu)譜線(圖4)。與正常牙周膜相比，經(jīng)過膠原酶降解的牙周膜樣本的α-螺旋、310-螺旋的相對含量增加，β-折疊的比值有所減小，β-回折的比值基本不變。此外，各結(jié)構(gòu)的峰中心也出現(xiàn)了偏移(表1)。

表2 膠原酶處理組和對照組酰胺Ⅲ帶二級結(jié)構(gòu)含量百分比Tab.2 The percentage of secondary structure of amide Ⅲ band in control group and collagenase Ⅰ treatment group

A：酶處理組；B：對照組

3 討 論

本研究使用拉曼光譜儀對牙周膜膠原蛋白的功能基團(tuán)精準(zhǔn)檢測，從分子層面探究膠原蛋白構(gòu)象的變化。實(shí)驗(yàn)獲得了牙周膜的拉曼光譜圖，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白的特征峰主要集中在酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅲ帶、CH2以及C—C鍵伸縮振動(dòng)，這與Perillo的研究結(jié)果基本一致[11]，除此之外研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸和苯丙氨酸也顯示了特征性的吸收峰。證明顯微拉曼檢測可應(yīng)用于牙周膜微觀構(gòu)象的研究。

牙周膜由多種膠原組成，其中主要是Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅴ型膠原，分別占75%[14]～78.06%[2]、20%、5%[15]。Ⅰ型膠原是結(jié)締組織中結(jié)構(gòu)蛋白的一種，廣泛存在于皮膚、韌帶等，是組織代謝和力學(xué)性能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在牙周膜成分中的含量最多，構(gòu)成了Ⅰ型膠原纖維。以往研究表明， 牙周膜Ⅰ型膠原的基因表達(dá)隨著牙周膜細(xì)胞的機(jī)械負(fù)載而改變[16-18]，在張力側(cè)、高咬合力處膠原表達(dá)增加。膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)可分為四級，其含量和排列決定了蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。崔素萍等[19]發(fā)現(xiàn)，蛋白的二級結(jié)構(gòu)會(huì)對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響。蛋白二級結(jié)構(gòu)指主鏈原子的空間構(gòu)象，主要包括：α-螺旋、β-折疊、β-回折、無規(guī)卷曲。其中，α-螺旋的肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成，具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，與牙周膜的彈性性能有關(guān)[11]。在本研究中，膠原蛋白在處理前后的拉曼光譜圖在酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅲ帶發(fā)生變化。在酰胺Ⅲ帶中，α-螺旋的相對含量減少，而β-回折、β-折疊和無規(guī)卷曲的含量增加。這說明膠原酶降解后，可能發(fā)生了二級結(jié)構(gòu)的互相轉(zhuǎn)化，并表現(xiàn)為膠原蛋白的結(jié)構(gòu)和性能的改變，α-螺旋維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的鏈內(nèi)氫鍵可能被破壞[20]。在酰胺Ⅰ帶中，α-螺旋的相對含量增加，β-折疊的相對含量減小，這表明牙周膜在膠原酶處理后，蛋白的二級結(jié)構(gòu)改變，破壞了蛋白的穩(wěn)定性，可能影響牙周膜的生物力學(xué)性能[21]。

Ⅰ型膠原酶在生理?xiàng)l件下能夠特異性地水解Ⅰ型膠原蛋白的空間結(jié)構(gòu)，而不損傷其他蛋白質(zhì)和組織[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)特異性研究了Ⅰ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)的變化。但是，膠原酶本身也是一種蛋白質(zhì)，不能忽略Ⅰ型膠原酶本身在拉曼檢測中對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，在樣本處理時(shí)需使用PBS緩沖液反復(fù)沖洗樣本以去除樣本表面的膠原酶殘留。

膠原纖維的降解出現(xiàn)在正畸治療或牙周潔治后牙齦炎癥緩解時(shí)[23-24]。在正畸治療中，患有嚴(yán)重牙周炎的錯(cuò)牙合畸形患者的牙齒移動(dòng)速率較正常減慢，這可能與牙周膜膠原結(jié)構(gòu)被破壞有關(guān)[25-26]。但是本研究僅探究了牙周膜樣本的蛋白結(jié)構(gòu)改變，在未來研究中，應(yīng)當(dāng)考慮與力學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，以進(jìn)一步定性定量探究蛋白結(jié)構(gòu)對牙周膜特性的影響。

4 結(jié) 論

本文通過顯微拉曼光譜檢測初步探究了人前磨牙牙周膜在Ⅰ型膠原酶處理后膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化，證明拉曼光譜應(yīng)用于牙周膜樣本的可行性。實(shí)驗(yàn)獲得了人牙周膜的拉曼光譜圖的特征峰，發(fā)現(xiàn)膠原酶處理后牙周膜膠原蛋白在酰胺Ⅲ帶和酰胺Ⅰ帶二級結(jié)構(gòu)光譜圖的特征峰位和峰面積改變，在酰胺Ⅲ帶的二級結(jié)構(gòu)相對含量的比值改變，提示牙周膜膠原降解后膠原蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性被破壞，可能會(huì)降低牙周膜的力學(xué)性能，為進(jìn)一步研究牙周膜生物力學(xué)特性提供參考。