王冬佳， 張 雄

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院口腔科，浙江 杭州 310006）

口腔頜面部創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤及先天畸形所致的頜骨缺損會(huì)給患者的生理和心理帶來極大的傷害[1-2]。因此，頜骨缺損的治療一直受到口腔醫(yī)生的重視。近年來，組織工程作為一門新興的交叉學(xué)科，發(fā)展迅速。將種子細(xì)胞和支架材料相復(fù)合的骨組織工程為頜骨缺損的功能修復(fù)與重建提出了新思路，其已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一[3-4]。

種子細(xì)胞和支架材料構(gòu)成了組織工程的核心部分[5-6]。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）因其易于分離培養(yǎng)、增殖能力強(qiáng)及免疫原性低，被認(rèn)為是最理想的種子細(xì)胞[7-8]。但是，正常動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下并不是無限增殖的。體外培養(yǎng)中的大多數(shù)細(xì)胞僅在有限的時(shí)間內(nèi)維持生長(zhǎng),然后自行停止生長(zhǎng)[9]。這種培養(yǎng)過程中所呈現(xiàn)的細(xì)胞增殖極限現(xiàn)象最初由Hayflick[10]在1961年觀察到，稱為“Hayflick極限”。

已有的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）在體外擴(kuò)增過程中會(huì)逐漸老化[11-12]。然而在實(shí)驗(yàn)研究中，研究者往往會(huì)使用不同代數(shù)的BMSCs進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。但是不同的細(xì)胞代數(shù)是否會(huì)對(duì)BMSCs的基本生物學(xué)特性產(chǎn)生影響，細(xì)胞體外增殖和成骨分化能力是否一致，細(xì)胞代數(shù)在幾代以內(nèi)可以用于實(shí)驗(yàn)研究而不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這些未曾報(bào)道過。在本研究中，通過比較P1、P3、P5、P7、P9 代 BMSCs的細(xì)胞形態(tài)、體外增殖和成骨分化能力，分析不同代數(shù)BMSCs在實(shí)驗(yàn)研究中是否對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡雄性SD大鼠由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱和離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Heraeus公司;酶標(biāo)儀、電子分析天平和掃描儀購(gòu)于瑞士Tecan公司;倒置顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司；PCR儀購(gòu)于瑞士Roche公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；青鏈霉素溶液購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、結(jié)晶紫溶液和ALP試劑盒購(gòu)于中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TRIzol試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠BMSCs原代培養(yǎng)、傳代和鑒定 采用骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)BMSCs。將SD大鼠頸椎脫臼處死后置于75%乙醇中浸泡15 min，于超凈工作臺(tái)內(nèi)取大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，用完全培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1 800 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min。將其接種于直徑為10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%左右時(shí)，常規(guī)消化、離心，按1∶3的比例傳代，隨著細(xì)胞傳代，細(xì)胞進(jìn)一步純化、擴(kuò)增，得到P1代BMSCs。按同樣的步驟獲得P3、P5代BMSCs。取生長(zhǎng)良好的BMSCs，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%時(shí)，常規(guī)消化、離心，制成5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，以每皿1 mL的量接種于熒光小皿中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，過夜。4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.3%Triton X-100溶液室溫作用15 min。5%二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）室溫封閉1 h，滴加1∶100稀釋比例的一抗CD44、CD90、 CD31、CD34，置 4 ℃過夜。室溫復(fù)溫 1 h，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 （4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染5 min，封片，熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 分別取 P1、P3、P5、P7、P9代BMSCs，0.25%胰酶消化、離心，棄上清液，配制密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。將配好的細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，倒置相差顯微鏡下采集圖像。將以上細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛置室溫下固定30 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗 3 次，每次5 min，用鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，將紅色鬼筆環(huán)肽以1∶500的比例稀釋后滴加在爬片上，于室溫下染色30 min，PBS漂洗3次，每次5 min。以1∶500的比例稀釋DAPI，置室溫染色5 min。封片劑封片，熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.3CCK-8法測(cè)定BMSCs生長(zhǎng)曲線 分別取P1、P3、P5、P7、P9 代 BMSCs，制作細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔含細(xì)胞數(shù)5 000個(gè)，邊緣用無菌PBS封閉。分別在第1、3、5、7天時(shí)使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞常規(guī)消化、離心，配制密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，將其接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，消化、離心，棄上清液，1×Binding緩沖液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)1×106個(gè)/mL，取100 μL到一個(gè)新的流式管中。選取3管正常細(xì)胞作為補(bǔ)償管：①雙陰性-正常細(xì)胞，不加入任何抗體；②Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）補(bǔ)償管，加入 Annexin V-FITC 抗體5 μL；③碘化丙啶（propidium iodide，PI）補(bǔ)償管，加入PI抗體5 μL。加入Annexin V-FITC抗體5 μL和PI抗體5 μL，置避光室溫 30 min。 最后加入 400 μL 1×Binding緩沖液，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5ALP染色及定量分析 分別取 P1、P3、P5、P7、P9代BMSCs接種于24孔板中，接種密度為5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后更換成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。7 d后棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min后，加入 ALP染色液，37℃避光孵育30 min。然后進(jìn)行ALP半定量分析，培養(yǎng)皿里加入 RIPA裂解液，冰上裂解 30 min，用蛋白定量試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，使用ALP半定量試劑盒檢測(cè)ALP濃度。最后用測(cè)出的ALP濃度除以總蛋白濃度計(jì)算出ALP半定量的結(jié)果。

1.2.6茜素紅染色及定量分析 分別取P1、P3、P5、P7、P9代BMSCs接種于24孔板中，接種密度為5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后更換成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。礦化誘導(dǎo)14 d后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的茜素紅染液，每孔加500 μL染液，37℃避光孵育30 min。棄去上清液，加入氯化十六烷基置室溫孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)590 nm波長(zhǎng)處吸光度值。

1.2.7RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá) 分別取 P1、P3、P5、P7、P9 代 BMSCs以 5×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后更換成骨誘導(dǎo)液。礦化誘導(dǎo)14 d后,棄上清液，PBS沖洗3次，每次5 min。每孔加入1 mL TRIzol試劑,冰上放置15 min，提取細(xì)胞的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)成骨標(biāo)志物Ⅰ型膠原 A1（COL1A1）和骨鈣素（OCN）的基因表達(dá)，引物序列見表1。反應(yīng)條件為95℃變性5 s，55℃退火15 s，72 ℃延伸 10 s，共 40 個(gè)循環(huán)。使用 2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定向量計(jì)算。

1.2.8免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá) 分別取P1、P3、P5、P7、P9代BMSCs接種于6孔板中，接種密度為5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)24 h后更換成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。礦化誘導(dǎo)14 d后,棄去上清液，PBS沖洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定液固定30 min后，PBS漂洗3次，每次5 min。滴加0.3%的Triton X-100溶液，處理細(xì)胞15 min，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透，用PBS漂洗3次。5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）置室溫封閉1 h后，加入1∶200的雙標(biāo)一抗COL1A1/OCN，4℃過夜。室溫放置復(fù)溫1 h后，去除雙標(biāo)一抗，用PBS漂洗3次，每次5 min。滴加雙二抗，置室溫孵育30 min。用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，置室溫5 min。熒光顯微鏡下采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。使用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，2組之間定量數(shù)值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析（analysis ofvariance，ANOVA）。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的原代培養(yǎng)、傳代和鑒定

采用骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠 BMSCs，培養(yǎng)72 h換液時(shí)可見部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞多呈梭性;第4天時(shí)，細(xì)胞形成較為分散的細(xì)胞群落，逐漸擴(kuò)散并相互交聯(lián)；第7天時(shí)，細(xì)胞集落呈漩渦狀排列，基本鋪滿培養(yǎng)皿，細(xì)胞生長(zhǎng)密度可達(dá)80%左右。免疫熒光染色鑒定大鼠BMSCs，結(jié)果顯示CD44和CD90在細(xì)胞膜上呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD31和CD34未見熒光（圖1）。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2.1光學(xué)顯微鏡觀察 如圖2所示，P1、P3、P5代BMSCs呈多角形，細(xì)胞之間相互交聯(lián)，細(xì)胞質(zhì)飽滿，狀態(tài)良好，胞質(zhì)均勻,核仁清晰,可見核分裂象。而P7、P9代BMSCs胞體相對(duì)較小，多呈梭形,細(xì)胞之間連接明顯減少，細(xì)胞皺縮，形態(tài)纖細(xì)，狀態(tài)較差。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖1 免疫熒光染色鑒定大鼠BMSCs（×200）Figure 1 Immunofluorescence detection of the cluster of differentiation on rat BMSCs （×200）

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察不同代數(shù)大鼠BMSCs（×100）Figure 2 Microscopic images of BMSCs in rats with different generations（×100）

2.2.2熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架 分別使用DAPI染液和鬼筆環(huán)肽對(duì) P1、P3、P5、P7、P9 代 BMSCs細(xì)胞核和細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)改變。如圖3所示，P1、P3、P5代BMSCs熒光染色均較強(qiáng)，分布規(guī)則且清晰，肌動(dòng)蛋白（actin）絲染色骨架均良好，胞質(zhì)飽滿，未見明顯差異。而P7和P9代BMSCs熒光染色弱，分布不規(guī)則，細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接顯著減少，細(xì)胞皺縮，形態(tài)纖細(xì)。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

CCK8 檢測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)胞接種后 1～7 d，P3、P5代BMSCs分別與P1代BMSCs增殖率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；細(xì)胞培養(yǎng) 3 d 之內(nèi)，P7、P9 代BMSCs分別與P1代BMSCs相比，細(xì)胞增殖率無明顯差異（P＞0.05）；細(xì)胞培養(yǎng) 3 d 之后，P7、P9 代細(xì)胞增殖率明顯降低，與 P1代BMSCs比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 詳見圖 4。

圖3 熒光顯微鏡下觀察不同代數(shù)大鼠BMSCs(×400)Figure 3 Immunofluorescence staining of BMSCs in rats with different generations(×400)

圖 4 P1、P3、P5、P7、P9 代 BMSCs 生長(zhǎng)曲線Figure 4 The growth curve of BMSCs in P1、P3、P5、P7 and P9

2.4 細(xì)胞凋亡分析結(jié)果

應(yīng) 用 流 式 細(xì) 胞 儀 檢 測(cè) P1、P3、P5、P7、P9 代BMSCs的凋亡情況，圖5A為3次流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果中的 1次。圖5B統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，P3、P5代BMSCs的細(xì)胞凋亡率分別與P1代BMSCs比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而 P7、P9 代 BMSCs分別與P1代BMSCs相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖 5 P1、P3、P5、P7、P9 代 BMSCs 細(xì)胞凋亡結(jié)果Figure 5 Cell apoptosis of BMSCs in P1,P3,P5,P7 and P9

2.5 ALP染色結(jié)果

BMSCs礦化誘導(dǎo)7 d后，ALP染色結(jié)果顯示，不同代數(shù)細(xì)胞均有藍(lán)色顆粒形成（圖6A），而且P1、P3、P5代細(xì)胞間的染色結(jié)果未見明顯差異，P7、P9代細(xì)胞染色效果相對(duì)較弱。為排除因?yàn)榻臃N細(xì)胞數(shù)量而引起的染色結(jié)果誤差，每代細(xì)胞均同時(shí)進(jìn)行ALP半定量檢測(cè)。結(jié)果顯示，P3、P5代BMSCs分別與 P1代BMSCs比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而 P7、P9代BMSCs分別與P1代BMSCs相比，ALP相對(duì)表達(dá)量顯著降低（圖 6B，P＜0.05）。

2.6 茜素紅染色結(jié)果

BMSCs礦化誘導(dǎo)14 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示，不同代數(shù)細(xì)胞均有紅色鈣結(jié)節(jié)形成（圖7A）。P1、P3、P5代細(xì)胞染色結(jié)果未見明顯差異，P7、P9代細(xì)胞染色效果相對(duì)較弱。為排除因?yàn)榻臃N細(xì)胞數(shù)量引起的染色結(jié)果誤差，每代細(xì)胞均同時(shí)進(jìn)行茜素紅半定量檢測(cè)。結(jié)果顯示，P3、P5代BMSCs分別與P1代BMSCs比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而 P7、P9代BMSCs分別與 P1代BMSCs相比，體外鈣結(jié)節(jié)形成能力顯著降低（圖 7B，P＜0.05）。

圖 6 P1、P3、P5 P7、P9 代 BMSCs ALP 活性表達(dá)Figure 6 Expression of ALP in P1,P3,P5,P7 and P9 of BMSCs

圖 7 P1、P3、P5、P7、P9 代 BMSCs 鈣結(jié)節(jié)形成結(jié)果Figure 7 Formation of calcium nodules in P1,P3,P5,P7 and P9 of BMSCs

2.7 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

RT-PCR檢測(cè)不同代數(shù)BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞成骨相關(guān)基因（COL1A1及OCN）mRNA的表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參基因，計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量。如圖 8所示，P3、P5代BMSCs分別與P1代BMSCs比較,COL1A1與OCN基因mRNA表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而 P7、P9 代 BMSCs分別與 P1代相比，其mRNA的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。

圖8 RT-PCR檢測(cè)不同代數(shù)BMSCs COLIA1和OCN mRNA的表達(dá)Figure 8 The mRNA expression of COL1A1 and OCN in different generations of BMSCs using RT-PCR

2.8 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

免疫熒光檢測(cè)不同代數(shù)BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后，細(xì)胞COL1A1及OCN蛋白的表達(dá)。如圖9所示，P1、P3、P5代 BMSCs COL1A1和 OCN 的雙標(biāo)熒光染色效果均較強(qiáng)，P3、P5代BMSCs分別與 P1代比較，COL1A1和OCN蛋白水平無明顯差異，P7和P9代BMSCs分別與P1代BMSCs比較,COL1A1和OCN雙標(biāo)熒光染色效果明顯減弱。

3 討論

Friedenstein等[13]于1976年最早發(fā)現(xiàn)骨髓中除了造血干細(xì)胞外,還存在一類基質(zhì)干細(xì)胞，隨即將其命名為間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）。MSCs是一類具有多向分化能力的干細(xì)胞，加之其易于分離培養(yǎng)、增殖能力強(qiáng)及免疫原性低的優(yōu)點(diǎn)，在再生醫(yī)學(xué)和組織工程中常常被認(rèn)為是最理想的種子細(xì)胞[14]。然而，有研究表明，大鼠BMSCs在體外培養(yǎng)過程中并不是無限制增殖的，會(huì)悄悄老化[9,15-17]。但是關(guān)于BMSCs在幾代以內(nèi)可以有效地保持其生物活性且不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的問題，至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè) P1、P3、P5、P7、P9代大鼠BMSCs增殖、凋亡能力，成骨分化和細(xì)胞形態(tài)學(xué)情況來進(jìn)行相關(guān)研究。

圖9 免疫熒光檢測(cè)不同代數(shù)BMSCs COL1A1和OCN蛋白表達(dá)（×400）Figure 9 Protein levels of COL1A1 and OCN in different generationsofBMSCsdetected by immunofluorescence staining （×400）

本實(shí)驗(yàn)采用骨髓貼壁培養(yǎng)法[18]分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，免疫熒光染色鑒定其干細(xì)胞特性[19]。結(jié)果顯示，細(xì)胞在傳代過程中，5代以內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，光學(xué)顯微鏡下顯示細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞集落呈漩渦狀排列；而P7、P9細(xì)胞胞體相對(duì)較小，多呈梭形,形態(tài)纖細(xì)，細(xì)胞與細(xì)胞之間間隙明顯增寬。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架的形態(tài)，結(jié)果顯示，P1、P3、P5代BMSCs細(xì)胞熒光染色效果均較強(qiáng)，分布規(guī)則且清晰，肌動(dòng)蛋白絲染色明顯，細(xì)胞骨架形態(tài)均良好，胞質(zhì)飽滿，未見明顯差異；而P7和P9代BMSCs細(xì)胞熒光染色效果弱，分布不規(guī)則，細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接體顯著減少，細(xì)胞皺縮，形態(tài)纖細(xì)。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示，P1、P3、P5代間BMSCs的增殖能力無明顯改變，而P7、P9代細(xì)胞增殖能力顯著降低。進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，P1、P3、P5代BMSCs細(xì)胞早期凋亡率無明顯改變，而P7和P9代BMSCs細(xì)胞早期凋亡率明顯升高。本研究證明，5代以內(nèi)的BMSCs，隨著細(xì)胞代數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)、體外增殖能力及細(xì)胞早期凋亡率無顯著差異，而5代以后，細(xì)胞形態(tài)改變明顯，體外增殖能力顯著降低，早期凋亡率明顯增高。

ALP染色和茜素紅染色半定量分析結(jié)果顯示，5代以內(nèi)的BMSCs隨著代數(shù)的增加，細(xì)胞體外成骨分化能力無明顯差異，而5代以后，細(xì)胞體外成骨分化能力顯著下降。骨鈣素（OCN）主要由骨和牙齒中的成骨細(xì)胞合成并分泌，是一種由成骨細(xì)胞分泌的特異性非膠質(zhì)蛋白，是體內(nèi)最豐富的非膠原骨基質(zhì)蛋白，與骨的形成和生長(zhǎng)密切相關(guān)[20]。保持正常的膠原代謝是人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)，Ⅰ型膠原A1（COL1A1）是維持骨結(jié)構(gòu)和骨生物力學(xué)特性的關(guān)鍵部分[21]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)OCN和COL1A1進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，BMSCs在5代以內(nèi)，隨著代數(shù)的增加，OCN和COL1A1基因表達(dá)無明顯差異，細(xì)胞在5代以后，兩者的基因表達(dá)顯著降低。免疫熒光染色檢測(cè)進(jìn)一步從蛋白水平表明，BMSCs在5代以內(nèi)，隨著代數(shù)的增加，OCN和COL1A1蛋白表達(dá)無明顯差異，細(xì)胞在5代以后，兩者的蛋白表達(dá)顯著降低。

綜上所述，本研究證明，BMSCs在5代以內(nèi)，其細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、早期凋亡率及體外成骨分化能力無明顯改變；而5代以后，各項(xiàng)指標(biāo)均顯著降低。因此，我們建議將5代以內(nèi)的大鼠BMSCs用于實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及成骨分化相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響。