王 曉， 郝新青， 王小萌， 閆廣興， 葉佳朋，齊春光， 孫宏晨， 史 冊， 黃 洋

（1.青島大學(xué)附屬青島市口腔醫(yī)院兒童口腔科，山東 青島 266000；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科，3.吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室，4.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，5.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，吉林 長春 130000；6.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院病理科，遼寧 沈陽 110000）

意外創(chuàng)傷、慢性炎癥和骨腫瘤等多種原因可以導(dǎo)致口腔頜面部骨缺損，對患者的生理和心理健康造成嚴(yán)重不良影響。曾作為修復(fù)骨缺損“金標(biāo)準(zhǔn)”的自體骨移植和異體骨移植存在來源有限和并發(fā)癥多等問題，應(yīng)運(yùn)而生的骨組織工程技術(shù)在促進(jìn)骨再生修復(fù)方面表現(xiàn)出巨大的潛力，成為當(dāng)今國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號通路是骨再生與骨重塑的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。近些年來，BMP在臨床骨缺損病例中得到大量應(yīng)用，但并沒有證據(jù)表明單獨應(yīng)用BMP的臨床療效優(yōu)于骨移植[1]。該結(jié)果提示，BMP在骨再生領(lǐng)域的應(yīng)用有待進(jìn)一步優(yōu)化。WNT信號通路也參與骨再生與骨重塑。有研究表明，在C3H10T1/2細(xì)胞中加入WNT3a能誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9（BMP-9）的表達(dá)，從而促進(jìn) BMP信號[2]。 又有研究表明，當(dāng)剪斷斑馬魚尾鰭后，首先發(fā)生WNT信號依賴性上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），進(jìn)而使 EMT來源的 Runx2+的前成骨細(xì)胞數(shù)量增加。在距離斷端較遠(yuǎn)處，WNT信號維持較高水平，有利于干細(xì)胞的自我更新，而距離斷端較近處的BMP2B表達(dá)上調(diào)，激活了BMP信號，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，直至再生過程結(jié)束[3]。這一研究提示，在骨形成的動態(tài)過程中，BMP和WNT在不同階段發(fā)揮不同作用，能夠協(xié)同促進(jìn)骨形成。因此，利用骨組織工程學(xué)原理構(gòu)建一種雙層復(fù)合材料載藥系統(tǒng)，順序激活BMP和WNT信號通路，有望發(fā)揮兩者在骨再生修復(fù)過程中的協(xié)同作用。

殼聚糖作為一種支架材料，在體外促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖及礦化骨基質(zhì)的形成等方面具有顯著效果[4]。海藻酸鈉復(fù)合材料在孔隙率、機(jī)械強(qiáng)度、生物相容性、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)、礦化和成骨分化等方面均表現(xiàn)出良好的生物學(xué)和理化性能，并作為藥物載體得到廣泛應(yīng)用[5]。利用支架材料作為載體與BMP等細(xì)胞因子結(jié)合能夠顯著提高成骨活性。但是細(xì)胞因子價格昂貴，無法廣泛應(yīng)用。具有相同或相似作用的生物小分子化合物成為良好的替代品。FK506作為BMP信號通路激活劑，能夠在體外促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，在體內(nèi)局部給藥可誘導(dǎo)礦化[6]。BIO為WNT信號通路激活劑，適宜濃度的BIO可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨向分化[7]。因此，我們設(shè)想通過構(gòu)建一種殼聚糖/海藻酸鈉雙層復(fù)合材料，使其分別負(fù)載BIO和FK506，達(dá)到順序釋放小分子化合物并順序激活相應(yīng)信號通路的目的，有望在骨缺損區(qū)域模擬骨發(fā)育和骨再生過程，以獲得更好的促進(jìn)骨再生效果。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

SZX體式顯微鏡，殼聚糖（Sigma公司，美國）；海藻酸鈉（光復(fù)精細(xì)化工有限公司，中國）；無水氯化鈣（西隴化工股份有限公司，中國）；FK506（Sigma公司，美國）；BIO（Sigma 公司，美國）；H-DMEM 培養(yǎng)液粉劑，胎牛血清，青鏈霉素雙抗（Gibco公司，美國）；胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，無錫傲銳東源生物科技有限公司，中國）；CCK-8試劑盒（Bimake公司，美國）；ALP染色試劑盒（Sigma公司，美國）；茜素紅（Sigma公司，美國）；RNA提取試劑盒（北京博邁德基因技術(shù)有限公司，中國）。

1.2 FK506和BIO濃度的確定

1.2.1FK506和BIO對前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞活性的影響 將小鼠前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞以5 000個/孔的密度接種于96孔板中，24 h后分別加入質(zhì)量濃度為 0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的 FK506 和濃度為 0.1、0.5、1.0、2.0 μmol/L 的 BIO，并以不加藥組為空白對照組。每3 d換液，分別于1、3、5、7 d 時進(jìn)行 CCK-8 檢測。

1.2.2FK506和BIO對前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞成骨向分化的影響 根據(jù)1.2.1的實驗結(jié)果對藥物濃度進(jìn)行初篩，確定無細(xì)胞毒性的藥物濃度范圍。將MC3T3-E1細(xì)胞以5 000個/孔的密度接種于24孔板中，24 h后分別加入質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0 μg/mL 的 FK506 和濃度為 0.1、0.5 μmol/L 的BIO，并以不加藥組為空白對照組，分別于7、14 d時進(jìn)行ALP染色，21 d時進(jìn)行茜素紅染色并定量。

1.3 殼聚糖/海藻酸鈉雙層復(fù)合材料的制備及表征

1.3.1殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料的制備 稱取1 g殼聚糖加入盛有50 mL蒸餾水的燒瓶中，磁力攪拌3 h后呈半透明狀，用醋酸調(diào)pH至中性，加入京尼平0.1 g，攪拌30 min后，移入6孔板中，置37°C孵箱過夜，次日取出，晾至常溫后置-80°C過夜，次日凍干。凍干后的殼聚糖為均勻一致的片狀，用銃子將其制備成直徑為5 mm的圓片狀，備用。稱取22.2 g無水氯化鈣加入盛有50 mL蒸餾水的燒瓶中，磁力攪拌至澄清透明的氯化鈣溶液，調(diào)pH至中性。稱取1.25 g海藻酸鈉加入盛有50 mL蒸餾水的燒瓶中，磁力攪拌均勻，調(diào)pH至中性，超聲振蕩至無氣泡。將制備的殼聚糖圓片在氯化鈣溶液中充分浸泡，在海藻酸鈉溶液中翻滾1 min后取出，制備出大小均勻的雙層復(fù)合結(jié)構(gòu)，將其置于氯化鈣溶液中浸泡8 h以上，使外層海藻酸鈉與氯化鈣反應(yīng)充分。

1.3.2殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料微觀形態(tài)的觀察 將制備好的殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料進(jìn)行冷凍干燥，掃描電鏡觀察其縱剖面。

1.3.3殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料的降解 取6個殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料置于盛有2 mL PBS的離心管中，放置于37°C孵箱中，分別于0、2、6、12 h和 1、2、3、5、7、14、21、28、35 d 時稱量。

1.3.4載藥殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料的制備及藥物釋放曲線的檢測 為了測定藥物的釋放曲線，我們合成了單獨在外層海藻酸鈉載FK506的復(fù)合材料及單獨在內(nèi)層殼聚糖載BIO的復(fù)合材料。采用紫外分光光度計繪制FK506和BIO的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分別檢測FK506和BIO的釋放規(guī)律。將單純外載FK506的復(fù)合材料置于盛有2 mL PBS的離心管中，并放置于 37 °C 孵箱中，分別于 2、6、12 h 和 1、2、3、5、7、14 d 時收集溶液， 測定 FK506 的濃度；將單純內(nèi)載BIO的復(fù)合材料置于盛有2 mL PBS的離心管中，并放置于 37 °C 孵箱中，分別于 1、2、3、5 d時收集溶液，測定BIO的濃度，檢測到釋放后，分別間隔6、12 h和1、2、3 d收集溶液，測定BIO的濃度。

1.4 殼聚糖/海藻酸鈉載藥復(fù)合材料對前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1成骨向分化的影響

制備不載藥的單純材料、內(nèi)載FK506+外載FK506、內(nèi)載 BIO+外載 FK506、內(nèi)載 BIO+外載 BIO和內(nèi)載FK506+外載BIO 5種不同材料。每組加入10 mL H-DMEM培養(yǎng)液，充分浸泡，24 h后收集材料浸提液，之后每間隔3 d收集材料浸提液。將MC3T3-E1細(xì)胞以5 000個/孔的密度接種于6孔板中，24 h后換為成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，加入不同材料浸提液，并設(shè)置不加材料浸提液的空白對照組，每3 d換液，分別于7、14 d進(jìn)行ALP染色，21 d進(jìn)行茜素紅染色。14 d收集細(xì)胞，提取mRNA，采用RT-qPCR方法檢測成骨相關(guān)基因 Runx2、Sp7和OCN的表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 7.0軟件處理數(shù)據(jù),通過非配對t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FK506和BIO對細(xì)胞存活和成骨分化的影響

應(yīng)用CCK-8法檢測不同質(zhì)量濃度的FK506和BIO對MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的影響（圖1）。與空白對照組（0 μg/mL）相比，F(xiàn)K506 組 1、3、5、7 d 均沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，F(xiàn)K506在質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL時的不同時間點均表現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞存活的能力，而質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL和4.0 μg/mL的FK506在5 d和7 d時，細(xì)胞的存活能力與對照組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1A）；BIO濃度為 1.0 μmol/L 和 2.0 μmol/L 時， 其 1、3、5、7 d 時表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，0.1 μmol/L的BIO在3、5 d時，細(xì)胞的存活能力高于對照組（圖1B）。因此，我們選擇 0.5、1.0、2.0 μg/mL 的 FK506 和 0.1、0.5 μmol/L的BIO進(jìn)行成骨細(xì)胞分化方面的實驗。

7 d和14 d的ALP染色結(jié)果顯示，F(xiàn)K506在2.0 μg/mL時，ALP 的活性高于其他組 （圖 2A、2B）；而21 d茜素紅染色及定量結(jié)果顯示，在BIO為0.1 μmol/L 時，鈣結(jié)節(jié)明顯多于其他組（圖 2C、2D）。這一結(jié)果說明在MC3T3-E1細(xì)胞的成骨向分化過程中，F(xiàn)K506在早期發(fā)揮促進(jìn)ALP活性的作用，BIO發(fā)揮長期作用有利于鈣結(jié)節(jié)的形成。因此，我們初步確定了后續(xù)實驗中用到的FK506的質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL，BIO 濃度為 0.1 μmol/L。

2.2 殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)

掃描電鏡結(jié)果顯示，外層海藻酸鈉均勻一致，緊密光滑；內(nèi)層殼聚糖具有較大的孔洞，多孔結(jié)構(gòu)比較疏松（圖3）。

圖1 不同濃度藥物對細(xì)胞存活的影響Figure 1 Effects of different concentrations of drugs on cell viability

圖2 不同濃度藥物對MC3T3-E1細(xì)胞成骨向分化的影響Figure 2 Effectsofdifferentconcentrationsofdrugson osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

圖3 殼聚糖/海藻酸鈉掃描電鏡圖Figure 3 Scanning electron microscope image of chitosan/sodium alginate composite

2.3 殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料的降解

實驗結(jié)果顯示，2 h時，材料降解率達(dá)14.10%，24 h內(nèi)緩慢穩(wěn)定降解，2 d時，降解率達(dá)27.24%，3 d時，達(dá)45.50%，5 d時，達(dá)74.05%，7 d時達(dá) 86.62%，14 d時，達(dá)88.22%，之后緩慢穩(wěn)定降解，至35 d時，降解率達(dá)94.28%（圖4）。

圖4 殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料降解曲線Figure 4 Degradation curve of chitosan/sodium alginate composite

2.4 殼聚糖/海藻酸鈉載藥復(fù)合材料藥物釋放規(guī)律

結(jié)果顯示，外層FK506緩慢持續(xù)釋放。如圖5A所示，6 h時，釋放率為11.22%，12 h時，為27.92%，1 d時，釋放率為46.72%，2 d時，為63.29%，3 d時，為72.38%，5 d時，達(dá)81.82%，7 d時進(jìn)入平臺期后，釋放率為89.86%，14 d時仍有少量藥物釋放，釋放率達(dá)90.37%。內(nèi)層BIO的釋放規(guī)律如圖5B所示，在5 d時檢測到藥物釋放，釋放率達(dá)17.63%，之后的 6、12、24、48 h 時 的 釋 放 率 分 別 為 29.03% 、50.90%、72.82%和90.96%，48 h后檢測不到藥物濃度。結(jié)果提示，內(nèi)層BIO在開始釋放后的48 h內(nèi)基本釋放完畢，之后可能有極小濃度的BIO釋放。

2.5 載藥殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料對前成骨細(xì)胞成骨向分化的影響

用載藥材料的浸提液處理前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1。ALP染色結(jié)果顯示，在7 d和14 d時，內(nèi)載BIO外載FK506的實驗組ALP染色強(qiáng)度及面積均較其他組強(qiáng)（圖6A、6B）。21 d茜素紅染色結(jié)果顯示，內(nèi)載BIO外載FK506的實驗組鈣結(jié)節(jié)明顯多于其他組 （圖6C、6D）。這一結(jié)果表明，先釋放FK506再釋放BIO能明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞在體外的成骨向分化。14 d時RT-qPCR結(jié)果（圖6E）顯示，與對照組相比，內(nèi)載BIO外載FK506組、內(nèi)載BIO外載BIO組、內(nèi)載FK506外載BIO組Runx2表達(dá)量明顯高于對照組，其中，內(nèi)載BIO外載FK506組升高最明顯（P<0.001）；與對照組相比，其他組OCN的表達(dá)量均明顯升高，其中內(nèi)載BIO外載FK506組升高最明顯（P<0.001）；除內(nèi)載FK506外載FK506組外，其余組Sp7表達(dá)量均有不同程度的降低。

圖5 載藥殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料藥物釋放規(guī)律Figure 5 Drug release of chitosan/sodium alginate composite loaded with drugs

圖6 載藥殼聚糖/海藻酸鈉復(fù)合材料對MC3T3-E1細(xì)胞成骨向分化的影響Figure 6 Effects of drug-loaded chitosan/sodium alginate composites on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

3 討論

BMP和WNT信號通路是骨形成和骨再生過程中2條重要的信號通路，這2種信號通路通過多種途徑發(fā)生復(fù)雜的相互作用，而這種相互作用既可以是相互協(xié)同的，也可以是相互拮抗的。因此，尋找一種有效的方法，發(fā)揮兩者的協(xié)同作用，抵消其拮抗作用有望獲得更有效的促進(jìn)骨再生效果。在本實驗中，我們構(gòu)建了內(nèi)外分別負(fù)載BIO和FK506的殼聚糖/海藻酸鈉雙層復(fù)合材料，使其順序激活BMP和WNT信號通路，并通過ALP染色、茜素紅染色和對成骨相關(guān)基因表達(dá)的檢測，對細(xì)胞在體外的成骨分化能力進(jìn)行評估。結(jié)果顯示，殼聚糖/海藻酸鈉水凝膠順序釋放FK506和BIO，順序激活BMP和WNT信號通路，促進(jìn)了前成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞在體外的成骨向分化。

本實驗中，我們根據(jù)斑馬魚尾鰭完全再生的實驗最先提出的假設(shè)為，WNT信號通路在早期發(fā)揮作用促進(jìn)細(xì)胞的增殖，BMP信號通路在晚期發(fā)揮作用促進(jìn)細(xì)胞的成骨向分化。而我們的ALP染色和茜素紅染色結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL的FK506，其早期促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨向分化的能力優(yōu)于BIO，而濃度為0.1 μmol/L的BIO促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成的能力優(yōu)于FK506。這與我們最初的假設(shè)相反，可能與BMP和WNT信號通路的交叉對話有關(guān)。有研究表明，在小鼠體內(nèi)成骨細(xì)胞中，特異性敲除Ⅰ型BMP受體Acvr1或Bmpr1a，小鼠骨量和骨密度均顯著增加，這是由于BMP受體缺失后，WNT信號抑制因子SOST和DKK1下調(diào)，WNT信號增高導(dǎo)致的[8]。結(jié)果表明，在成骨細(xì)胞分化和骨重塑過程中，BMP信號會抑制WNT信號，而WNT信號的升高有利于礦化基質(zhì)的形成。因此，在本實驗中，細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，BIO組鈣結(jié)節(jié)形成能力更強(qiáng)（圖2C），也進(jìn)一步證實WNT信號在成骨細(xì)胞分化末期發(fā)揮促進(jìn)礦化的作用。進(jìn)一步的實驗結(jié)果顯示，內(nèi)載BIO外載FK506的實驗組鈣結(jié)節(jié)形成量明顯多于其他組（圖6D），表明BMP和WNT信號的順序激活，能夠部分抵消BMP信號對WNT信號的抑制作用，且能使WNT信號進(jìn)一步發(fā)揮促進(jìn)礦化的作用，從而更有效地促進(jìn)成骨向分化。

結(jié)果顯示，在載藥復(fù)合材料浸提液作用下的前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，Runx2和OCN的表達(dá)明顯升高，尤其是內(nèi)載BIO外載FK506組；而同樣作為成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的Sp7的相對表達(dá)量則出現(xiàn)了降低現(xiàn)象（圖6E），這可能與成骨細(xì)胞所處的分化時期有關(guān)。有研究表明，Sp7主要在小鼠成骨細(xì)胞分化的早期發(fā)揮作用，而抑制了成骨細(xì)胞的晚期分化[9]。隨著成骨細(xì)胞的分化成熟及礦化結(jié)節(jié)的形成，Sp7的表達(dá)逐漸減少。在本實驗中，OCN的表達(dá)顯著升高，說明成骨細(xì)胞處于晚期分化階段，此時Sp7表達(dá)被抑制。因此，與對照組相比，除內(nèi)載FK506外載FK506組外，其余組Sp7表達(dá)降低。又有研究表明，在體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)過程中，Sp7的表達(dá)是隨著BMP信號的增強(qiáng)而增加的[10]。在本實驗中，14 d時，外層材料大部分降解完成（圖4），BMP信號通路激活劑FK506已基本釋放完畢（圖5A），BMP信號較早期減弱，這可能是內(nèi)載FK506外載FK506組Sp7表達(dá)無變化，而其他組Sp7相對表達(dá)量降低的原因之一。

殼聚糖作為藥物載體的缺點是藥物的突釋現(xiàn)象，即藥物在短期內(nèi)快速大量釋放。有文獻(xiàn)報道，用海藻酸鹽等聚合物包覆殼聚糖微球，可提高藥物包封率，增加穩(wěn)定性，減少所含治療劑的瞬時大量釋放[11]。在本實驗中，內(nèi)層殼聚糖所載BIO在第5天時開始釋放，48 h內(nèi)逐步釋放完成，有一定的緩釋作用，有效減少了藥物的突釋，使得材料的性能得以優(yōu)化，有望在臨床中得到應(yīng)用。

綜上所述，BMP和WNT信號通路的順序激活，能夠充分發(fā)揮2種信號通路的協(xié)同作用，減弱其拮抗作用。本實驗構(gòu)建的殼聚糖/海藻酸鈉水凝膠能夠順序釋放BMP和WNT信號通路激活劑，進(jìn)而有效促進(jìn)前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1在體外的成骨向分化。這為臨床治療骨缺損、促進(jìn)骨再生提供了新的思路。