陸長璽， 郭傳瑸

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔綜合科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011；2.北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，北京 100081）

在原發(fā)腫瘤逐漸侵襲的過程中，除抑制腫瘤細胞增生外，降解細胞外基質(zhì)的能力對腫瘤的侵襲也十分重要。細胞外基質(zhì)的降解主要靠蛋白水解酶?；|(zhì)金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinase，MMP）是4類蛋白水解酶（絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天門冬氨酸蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶）中較重要的一類。

MMP是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，經(jīng)典型MMP以水溶性酶原形式分泌到細胞外，需要在激活劑作用下才具有酶活性；新型MMP則不同，分泌型MMP直接以活性酶的形式分泌到細胞外，而另一種膜型的MMP則結(jié)合在胞膜上。研究表明，在多種類型的腫瘤系中，MMP的表達水平和活性水平與其侵襲性和轉(zhuǎn)移成正相關(guān)[1-5]。

MMP-2也稱為Ⅳ型膠原酶，其可以降解Ⅳ型膠原，Ⅳ型膠原同時也是構(gòu)成基底膜的主要膠原成分。研究普遍認為，MMP-2水平可能是腫瘤惡性程度的標(biāo)志之一。本研究對MMP-2在成釉細胞瘤體及骨組織中的表達進行檢測，探討其在成釉細胞瘤侵襲及骨破壞過程中的作用。

1 資料和方法

1.1 組織標(biāo)本準(zhǔn)備

石蠟標(biāo)本共26塊，為2005—2009年北京大學(xué)口腔醫(yī)院手術(shù)所得，其中確診為成釉細胞瘤的標(biāo)本為25塊，惡性成釉細胞瘤為1塊。成釉細胞瘤病理類型包括單囊型（11例）、一般型（13例）及角化型（1例）。其中，一般型又可分為4個亞型：濾泡型、叢狀型、棘皮瘤型、顆粒細胞型。標(biāo)本均用10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）充分脫鈣后進行連續(xù)切片，切片厚度為5 μm，隨后進行免疫組化染色。

1.2 免疫組化染色

試劑包括免疫組化通用型試劑盒,兔抗人MMP-2多克隆抗體,增強聚合物法染色劑（diaminobenzidine,DAB）。以上試劑均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

染色過程：石蠟切片，60℃烤片2 d后，常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸溶液下微波抗原熱修復(fù)15 min，3%過氧化氫去離子水孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化氫酶活性；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）沖洗3次，每次3 min，滴加正常山羊血清工作液（A液）置室溫孵育15 min，傾去，滴加MMP-2多克隆抗體（一抗），37℃下孵育3 h；PBS沖洗3次，每次3 min，滴加生物素化山羊抗兔IgG（B液）置室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（C液）置室溫孵育15 min；PBS沖洗3次，每次3 min，DAB顯色劑顯色，自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片劑封片。

1.3 結(jié)果判斷

因細胞較少，本研究采取如下方法判斷：MMP-2陽性染色定位于細胞質(zhì)，在高倍鏡下觀察，深褐色區(qū)域>50%為強陽性,26%～50%為中等陽性，5%～25%或僅有少量斑點為弱陽性，<5%為陰性。此外，因細胞數(shù)過少或其他原因無法確定的標(biāo)本判定為“不確定”。分別將已知的陽性片和PBS代替一抗（MMP-2）設(shè)為陽性和陰性對照。

1.4 結(jié)果分析

分析軟組織中MMP-2的表達，包括腫瘤組織及基質(zhì)組織。分析骨組織中MMP-2的表達，探討其與骨侵襲性的關(guān)系。分析各型成釉細胞瘤中MMP-2的表達是否有差異，以及此差異是否與侵襲性相關(guān)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計MMP-2表達的總陽性率，比較各病理類型的陽性率，使用SPSS 16.0軟件進行χ2檢驗及方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2染色結(jié)果

在成釉細胞瘤中，絕大部分MMP-2強陽性表達存在于外周柱狀細胞的胞質(zhì)中，少量細胞膜呈MMP-2陽性表達，中心星網(wǎng)狀細胞少見或未見表達。許多基質(zhì)中類似成纖維細胞的組織也存在MMP-2的陽性表達。

如圖1所示，在單囊型成釉細胞瘤的囊壁細胞內(nèi)，MMP-2呈強陽性表達，MMP-2在囊壁基底層呈強陽性表達,纖維結(jié)締組織中也有MMP-2的強陽性表達；腫瘤組織少部分外層柱狀細胞質(zhì)內(nèi)可見MMP-2表達（白色箭頭），少量中心星網(wǎng)狀分化細胞可見MMP-2表達（紅色箭頭）。所以，單囊型MMP-2的表達主要發(fā)生在基質(zhì)中。

圖1 單囊型成釉細胞瘤免疫組化染色圖（×200）Figure 1 Immunohistochemistry staining of unicystic ameloblastoma （×200）

如圖2所示，叢狀型成釉細胞瘤免疫組化染色可見腫瘤上皮島外周柱狀細胞質(zhì)內(nèi)有MMP-2陽性表達，基質(zhì)中出現(xiàn)MMP-2強陽性表達；神經(jīng)組織外周也有MMP-2陽性表達（白色箭頭）。

圖2 叢狀型成釉細胞瘤免疫組化染色圖（×400）Figure 2 Immunohistochemistry staining of plexiform ameloblastoma （×400）

如圖3所示，角化型成釉細胞瘤免疫組化染色結(jié)果顯示，腫瘤細胞中心為角化物，MMP-2呈強陽性表達，外周柱狀細胞質(zhì)呈MMP-2強陽性表達。

圖3 角化型成釉細胞瘤免疫組化染色圖，腫瘤及角化物（×400）Figure 3 Immunohistochemistry staining of keratotic ameloblastoma,tumor and keratin （×400）

惡性成釉細胞瘤免疫組化染色結(jié)果顯示，腫瘤細胞排列無規(guī)律，可見核分裂象，整個腫瘤組織中的細胞質(zhì)中均有MMP-2陽性表達（圖4）。

2.2 統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

本研究中，MMP-2表達的總陽性率為88.5%，強陽性率為65.4%，中等陽性率為15.4%，弱陽性率為7.7%，陰性率為3.8%，不確定的為7.7%。其中，一般型成釉細胞瘤MMP-2表達的總陽性率為76.9%，強陽性率為61.5%，中等陽性率為7.7%，弱陽性率為7.7%，陰性率為7.7%，不確定的為15.4%；單囊型成釉細胞瘤MMP-2表達的總陽性率為100%，強陽性率為63.6%，中等陽性率為27.3%，弱陽性率為9.1%，無陰性及不確定的病例；角化型及惡性成釉細胞瘤均呈MMP-2強陽性表達。不同病理類型成釉細胞瘤中MMP-2的表達情況見表1。

將一般型及單囊型成釉細胞瘤MMP-2陽性率進行卡方檢驗，結(jié)果顯示兩者MMP-2的表達無明顯差異（P>0.05）。

圖4 惡性成釉細胞瘤免疫組化染色圖 （×400）Figure 4 Immunohistochemistry staining of malignant ameloblastoma （×400）

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)展過程中，癌細胞必須突破基底膜才能從原位癌向周圍組織侵襲，進而發(fā)展成為浸潤癌?；啄な悄[瘤細胞侵襲生長的主要屏障，主要成分有Ⅳ型膠原、層連蛋白（laminin,Lm）和纖維粘連蛋白（fibronectin,Fn）等，其中Ⅳ型膠原可能是最主要、最穩(wěn)定的成分。MMP幾乎可以降解所有細胞外基質(zhì) （extracellular matrix,ECM）和基底膜（basement membrane,BM）成分，在腫瘤細胞突破基底膜和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[6]。

MMP在腫瘤細胞移動侵襲過程中的多重作用主要為直接降解基底膜成分。如MMP-2可水解Ⅳ型膠原，破壞基底膜的完整性；調(diào)節(jié)細胞黏附，打破原有的黏結(jié)，形成新的細胞間及細胞基質(zhì)間的黏附，有利于細胞的游走；MMP作用于ECM能激活生成新的活性因子，產(chǎn)生一系列反應(yīng)[7]。

表1 不同病理類型成釉細胞瘤中MMP-2的表達情況（例）Table 1 Expression of MMP-2 in different pathological types of ameloblastoma （case）

成釉細胞瘤雖然是良性腫瘤，但包膜不完整，具有局部侵襲性。有學(xué)者從細胞增殖活力的角度分析了成釉細胞瘤的生物學(xué)行為，通過對成釉細胞瘤和角化囊腫細胞的體外培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)，兩者的細胞生長特點不同，前者細胞增殖活躍，具有主動性生長的特點，細胞向周圍游走的能力強；而后者細胞的膨脹性生長能力強，能使病變范圍變大，并具有術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點。Piattelli等[8]的研究表明，成釉細胞瘤的增殖細胞核抗原 （proliferating cell nuclear antigen，PCNA）細胞主要集中在腫瘤上皮島的外周細胞上，提示外周細胞的增殖活躍，在成釉細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。

關(guān)于基底膜和蛋白水解酶等在成釉細胞瘤局部侵襲中作用的研究尚少。本研究利用免疫組化的方法對MMP-2在成釉細胞瘤中的表達和分布進行研究，發(fā)現(xiàn)在26例成釉細胞瘤中，對于基質(zhì)細胞，有24例可見MMP-2強陽性染色；對于腫瘤細胞，大部分MMP-2陽性表達位于外周柱狀細胞,中心星網(wǎng)狀細胞少見或未見表達。

本研究中，MMP-2表達的總陽性率為88.5%，強陽性率為65.4%，陰性率為3.8%。Kumamoto等[9]的研究顯示，MMP-2表達的總陽性率為93.2%，強陽性率為45.5%，陰性率為6.8%。Fregnani等[10]的研究顯示，腫瘤細胞中MMP-2表達的陽性率為47.3%，基質(zhì)細胞中為38.2%，總陽性率為85.5%。陶謙等[6]的研究顯示，MMP-2表達的總陽性率為92%，強陽性率為84%，陰性率為8%。孫福星等[11]的研究顯示，中等至強的陽性率為79%。以上結(jié)果顯示，各研究的總陽性率差別較小，而強陽性率差別較大，可能與實驗條件和判斷標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。

角化型成釉細胞瘤的外周柱狀細胞胞質(zhì)中，MMP-2呈強陽性表達，其角化物中的MMP-2也呈現(xiàn)強陽性表達，這提示了角化型成釉細胞瘤的侵襲性可能大大強于單囊型及一般型成釉細胞瘤。

1例惡性成釉細胞瘤中，腫瘤組織不呈現(xiàn)“成釉器”樣表現(xiàn)，MMP-2的陽性表達也不局限在外周細胞，在中心部分也有強陽性表達。

本研究結(jié)果提示，成釉細胞瘤的外周細胞或基質(zhì)細胞中產(chǎn)生的MMP-2可致基底膜成分Ⅳ型膠原降解，破壞基底膜的完整性，這可能是成釉細胞瘤局部侵襲生長的機制之一。但不同病理類型間的MMP-2表達并無顯著差異（P>0.05）。Fregnani等[10]將叢狀型與其他病理類型的成釉細胞瘤比較，MMP-2的表達無顯著差異（P>0.05）。Kumamoto等[9]比較了叢狀型和濾泡型成釉細胞瘤中MMP-2的表達，未見明顯差異（P>0.05）。陶謙等[6]的研究則提示，MMP-2的表達與是否為單囊型或一般型無關(guān)，但成釉細胞瘤與角化囊腫及含牙囊腫間的差異顯著。

臨床上，一般型成釉細胞瘤的復(fù)發(fā)率較單囊型高，主要原因可能并不在于MMP-2的表達或侵襲的深度，而是由于單囊型成釉細胞瘤無實性瘤體，邊界光滑，容易刮治，而一般型成釉細胞瘤為多囊，呈囊實性混合腫塊，其對骨壁的不規(guī)則侵襲造成瘤體不易被刮凈，而需采用一定邊界范圍的切除法。