陳海姣，吳淼淼，劉鵬飛，張 婷，朱 琳，江柯煒，沈衛(wèi)東

胃癌在中國(guó)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，手術(shù)切除為主要的治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率較高。根治性手術(shù)治療進(jìn)展期胃癌5年生存率約為40%，患者主要死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而淋巴轉(zhuǎn)移是其最主要的轉(zhuǎn)移方式[1]。但迄今為止，胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制卻不明確[2-4]。

液泡-ATP酶（vacular-ATPases，V-ATPases）是傳統(tǒng)的質(zhì)子泵，普遍存在于從酵母至人類的真核生物中。在正常細(xì)胞中，V-ATPases主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，其功能為保持細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)中性pH值和細(xì)胞器內(nèi)的酸性pH值。近來發(fā)現(xiàn)，V-ATPases在一些疾病的發(fā)生及進(jìn)展中具有重要的作用，如骨質(zhì)疏松、腎小管酸中毒以及男性不育等，尤其與腫瘤的惡性生物學(xué)行為關(guān)系密切，已成為新的研究焦點(diǎn)之一[5-6]。在腫瘤組織細(xì)胞的細(xì)胞膜及囊泡膜上V-ATPases表達(dá)顯著高于正常組織[7]，有助于腫瘤細(xì)胞將H＋泵出膜外或泵入囊泡內(nèi)，使得細(xì)胞外、囊泡和溶酶體酸化，從而維持腫瘤細(xì)胞外和囊泡內(nèi)酸性環(huán)境并使細(xì)胞脫離H＋的危害，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[8-9]。因此，V-ATPases已成為具有良好前景的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移靶標(biāo)。巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1）是V-ATPases的抑制劑[10]，本研究中利用巴佛洛霉素A1來觀察對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的遷移和侵襲的作用。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）包括多個(gè)亞型VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D，在新生淋巴管的形成中起著非常重要的作用[4-6]。它能維持內(nèi)皮細(xì)胞的存活，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，募集骨髓源性的造血祖或干細(xì)胞誘導(dǎo)脈管形成，增加脈管通透性。腫瘤細(xì)胞過表達(dá)VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D，分別與淋巴內(nèi)皮細(xì)胞VEGF受體2（VEGF receptor 2，VEGFR2）和VEGFR3相結(jié)合，促進(jìn)新生淋巴管形成[6-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，用藥物抑制食管癌細(xì)胞V-ATPases活性，會(huì)引起VEGF-C表達(dá)的降低以及新生血管形成減少[11]。近來的一些研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）能通過缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）調(diào)控腫瘤細(xì)胞中VEGF的分泌，進(jìn)而影響腫瘤新生脈管的形成[12-16]。因此本研究旨在探討巴佛洛霉素A1抑制V-ATPases活性之后，對(duì)胃癌細(xì)胞中VEGF-C表達(dá)以及細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

人胃癌SGC-7901細(xì)胞和人臍靜脈細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。DMEM高糖培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清和含EDTA的0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，巴佛洛霉素A1購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（用DMSO溶解后，－20 ℃條件下保存）。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁株式會(huì)社化學(xué)研究所、RIPA裂解液、PMSF酶抑制劑、BCA蛋白濃度定量試劑盒、SDSPAGE凝膠制備試劑盒和結(jié)晶紫染液均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cloud-Clone公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，V-ATPases分析試劑盒（GMS50247.1）購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自日本TaKaRa公司；基質(zhì)膠（martrigel）購(gòu)自美國(guó)BD公司。兔抗人GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，兔抗人VEGF-C單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Omnimabs公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG及電化學(xué)發(fā)光劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。GAPDH和VEGF-C基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

倒置光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：CKX41）為日本Olympus公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)：CFX96）、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、分光光度儀（SmartSpec Plus）及凝膠成像分析儀（SYSTEM GelDoc XR＋）均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：T-3111）為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，高速離心機(jī)[型號(hào)：5810（R）]為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品，臺(tái)式實(shí)驗(yàn)pH計(jì)為瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞和HUVECs用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 V-ATPases活性及培養(yǎng)液pH值檢測(cè)

將SGC-7901細(xì)胞（1×106個(gè)）接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16 h后，在細(xì)胞中加入終濃度為10 nmol/mL的巴佛洛霉素A1（以加入不含任何藥物的培養(yǎng)液處理SGC-7901細(xì)胞為對(duì)照組）。藥物處理24 h后收集細(xì)胞，按V-ATPases分析試劑盒提供的操作說明，提取細(xì)胞內(nèi)的V-ATPases，隨后在分光光度儀上波長(zhǎng)340 nm處每隔5 min（0～20 min）檢測(cè)樣品的D值；獲得的數(shù)據(jù)，按試劑盒提供的操作說明進(jìn)行換算，數(shù)據(jù)單位為unit/μg。

同時(shí)收集2組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，用pH計(jì)測(cè)量上清液的pH值。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SGC-7901細(xì)胞，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后，進(jìn)行計(jì)數(shù)；按5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)16 h后加入巴佛洛霉素A1進(jìn)行處理，細(xì)胞分組及藥物處理同1.2.2節(jié)。藥物處理24 h后加入CCK-8試劑孵育1.5 h后，上酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔細(xì)胞的D值，并用GraphPad Prism5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)獲得的D值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下觀察，巴佛洛霉素A1進(jìn)行處理后對(duì)SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)巴佛洛霉素A1對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移能力的影響

收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SGC-7901細(xì)胞，按5×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于Transwell小室的上室中培養(yǎng)20 h后加入終濃度為10 nmol/mL的巴佛洛霉素A1（用不含血清的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋），細(xì)胞分組及藥物處理同1.2.2節(jié)。小室的小室中則加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出小室，擦除未穿過小室膜的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色細(xì)胞15 min；用PBS洗膜3次，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)（放大倍數(shù)為400倍）并計(jì)數(shù)細(xì)胞（隨機(jī)計(jì)算5個(gè)視野）。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C蛋白的表達(dá)量

將SGC-7901細(xì)胞按5×105個(gè)細(xì)胞/皿的密度接種于直徑為3 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16 h待細(xì)胞融合度為60%～70%時(shí)，更換為含藥物的培養(yǎng)液，細(xì)胞分組及藥物處理同1.2.2節(jié)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后7 500×g離心10 min收集上清液，除去沉淀；各取50 μL培養(yǎng)上清液按照ELISA試劑盒操作說明提供的方法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中VEGF-C蛋白的表達(dá)量。獲得的數(shù)據(jù)用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)VEGF-C mRNA的表達(dá)水平

將SGC-7901細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞/皿的密度接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16 h待細(xì)胞融合度為60%～70%時(shí)，更換含藥物的培養(yǎng)液，細(xì)胞分組及藥物處理同1.2.2節(jié)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系的配制按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒提供的操作說明。擴(kuò)增條件為95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃15 s，最后95 ℃ 15 s。用2－ΔΔCt值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。VEGF-C基因上游引物序列為5’-GAGCAGTTACGGTCTGTGTCC-3’，下游引物序列為5’-CTGTCCTTGAGTTGAGGTTGG-3’；內(nèi)參照基因GAPDH引物為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。

1.2.7 蛋白印跡法檢測(cè)

收集SGC-7901細(xì)胞，用巴佛洛霉素A1處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞分組及藥物處理同1.2.2節(jié)；消化并收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液和PMSF酶抑制劑處理細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，并用BCA法對(duì)收集獲得的蛋白定量。取15 mg總蛋白上樣，行SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用封閉液（含5%脫脂奶粉的PBST）封閉處理1 h，分別加入一抗[兔抗人GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶1 000）和兔抗人VEGF-C單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶200）]4 ℃反應(yīng)過夜；用TBS洗膜3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（工作液的體積稀釋比例參閱抗體試劑盒的操作說明）常溫孵育2 h；最后滴加電化學(xué)試劑后顯影。采用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白VEGF-C條帶灰度值與內(nèi)參照GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 HUVECs成管實(shí)驗(yàn)

收集SGC-7901細(xì)胞，用巴佛洛霉素A1處理24 h后常規(guī)離心10 min，取上清液－80 ℃保存?zhèn)溆谩?×104個(gè)HUVECs接種在預(yù)先用基質(zhì)膠包被的24孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)液更換為之前收集的SGC-7901細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)6 h后，去除上清液，用PBS清洗細(xì)胞2次，然后用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗3次（5 min/次）；在光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為400倍）觀察HUVECs的成管情況。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料用表示，計(jì)數(shù)資料用整數(shù)表示。組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巴佛洛霉素A1抑制SGC-7901細(xì)胞中V-ATPases的活性

用V-ATPases抑制劑巴佛洛霉素A1處理胃癌SGC-7901細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞中V-ATPases的活性。結(jié)果（圖1A）顯示，對(duì)照組與巴佛洛霉素A1組SGC-7901細(xì)胞的V-ATPases活性分別為（0.026 0±0.000 4）unit/μg和（0.021 5±0.000 6）unit/μg；與對(duì)照組相比，巴佛洛霉素A1組SGC-7901細(xì)胞中V-ATPases的活性減弱（P＜0.05）。

隨后檢測(cè)2組細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值。結(jié)果（圖1B）顯示，對(duì)照組培養(yǎng)液的pH值為6.375±0.045，巴佛洛霉素A1組為7.090±0.070；與對(duì)照組相比，巴佛洛霉素A1作用后細(xì)胞外的pH值上升酸性減弱（P＜0.05）。

上述結(jié)果提示，巴佛洛霉素A1作用于SGC-7901細(xì)胞后，能抑制V-ATPases的活性，從而使其向細(xì)胞外傳遞H＋的能力減弱。

2.2 巴佛洛霉素A1抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力

用巴佛洛霉素A1（10 nmol/mL）處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，觀察藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果（圖2A）發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，巴佛洛霉素A1組SGC-7901細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變，且可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。進(jìn)一步用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果（圖2B）發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞的D值為1.354±0.022，巴佛洛霉素A1組為1.103±0.007；巴佛洛霉素A1組細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組被明顯抑制（P＜0.05）。提示巴佛洛霉素A1能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖能力。

本研究中進(jìn)一步用Transwell小室檢測(cè)巴佛洛霉素A1對(duì)SGC-7901細(xì)胞的遷移能力的影響。結(jié)果（圖2C）顯示，對(duì)照組與巴佛洛霉素A1組SGC-7901細(xì)胞發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)分別為（63.250±5.218）個(gè)和（21.170±4.347）個(gè)；與對(duì)照組相比，巴佛洛霉素A1組發(fā)生遷移的細(xì)胞明顯減少（P＜0.05）。

2.3 巴佛洛霉素A1抑制SGC-7901細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)

有研究提示，VEGF與腫瘤的發(fā)生和遷移有關(guān)[16-17]，因此本研究中進(jìn)一步采用ELISA法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了巴佛洛霉素A1（10 nmol/mL）處理后對(duì)SGC-7901細(xì)胞中VEGF-C表達(dá)的影響。

ELISA法檢測(cè)結(jié)果（圖3A）顯示，50 μL對(duì)照組和巴佛洛霉素A1組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C的含量分別為（322.5±23.50）μg和（190.0±19.00）μg；與對(duì)照組相比，巴佛洛霉素A1組細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的VEGF-C表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）。

Fig.1 The vacuolar-ATPases (V-ATPases) activity of gastric cancer SGC-7901 cells treated with Bafilomycin A1 (10 nmol/mL) was detected by a V-ATPases kit,and the extracellular pH value of SGC-7901 cells treated with Bafilomycin A1 (10 nmol/mL) was measured with a pH meter.SGC-7901 cells treated without any drugs were used as the control for V-ATPases assay,and the same volume of the medium as the drug-treated group was used as the control for extracellular pH detection.Bafilomycin A1 could significantly reduce the V-ATPases activity (A) and increased the extracellular pH value (B).*P＜0.05,vs the control group (n=3).圖1 巴佛洛霉素A1對(duì)SGC-7901細(xì)胞V-ATPases活性（A）以及細(xì)胞外pH值的影響（B）

Fig.2 The cell morphology of gastric cancer SGC-7901 cells treated with Bafilomycin A1 (10 nmol/mL) was observed under optical microscope (A),the cell proliferation was detected by the CCK-8 method (B),and the migration ability was detected by Transwell chamber assay (crystal violet staining,×400) (C).SGC-7901 cells were treated without any drugs as the control.Bafilomycin A1 significantly inhibited cell proliferation and significantly reduced cell migration ability.*P＜0.05,vs the control group (n=3).圖2 巴佛洛霉素A1處理后光學(xué)顯微鏡下觀察SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的改變情況（A），CCK-8法和Transwell小室法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖（B）和遷移（C）能力的影響

Fig.3 The vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) secretion of SGC-7901 cells treated with Bafilomycin A1 (10 nmol/mL) was detected by ELISA method,Bafilomycin A1 significantly reduced the VEGF-C secretion into cell culture supernatant (A);the expression level of VEGF-C mRNA (B) and VEGF-C protein (C) in SGC-7901 cells treated with Bafilomycin A1 (10 nmol/mL) were detected by realtime fluorescent quantitative PCR and Western blotting,respectively.SGC-7901 cells were treated without any drugs as the control.Bafilomycin A1 significantly down-regulated the expression levels of VEGF-C mRNA and VEGF-C protein.*P＜0.05,vs the control group (n=3).圖3 采用ELISA法（A）檢測(cè)巴佛洛霉素A1對(duì)SGC-7901細(xì)胞分泌VEGF-C能力的影響，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（B）和蛋白質(zhì)印跡法（C）檢測(cè)對(duì)SGC-7901細(xì)胞中VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，巴佛洛霉素A1組SGC-7901細(xì)胞中VEGF-C mRNA（圖3B）和蛋白（圖3C）的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P值均＜0.05）。

上述結(jié)果提示，巴佛洛霉素A1可能通過影響SGC-7901細(xì)胞的VEGF-C表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的遷移[15]。

2.4 巴佛洛霉素A1處理后的SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)HUVECs成管能力影響

將用巴佛洛霉素A1（10 nmol/mL）處理24 h的SGC-7901細(xì)胞的上清液與HUVECs共培養(yǎng)。結(jié)果（圖4）顯示，對(duì)照組巴佛洛霉素A1組中HUVECs形成的三維管狀結(jié)構(gòu)分別為（47.17±4.963）個(gè)和（25.17±4.324）個(gè)，巴佛洛霉素A1處理后能明顯抑制HUVECs成管數(shù)（P＜0.05）。藥物處理過的上清液中，可能由于部分細(xì)胞分泌因子的改變，如VEGF-C分泌水平的降低，使HUVECs的成管能力顯著減弱。

Fig.4 The number of tubular structures formed by human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)cultured with SGC-7901 cell’s supernatant treated with bafilomycin A1 was observed under optical microscope (crystal violet staining,×400).SGC-7901 cells were treated without any drugs as the control.Compared with the control group,the number of tubular in the Bafilomycin A1 group significantly decreased.*P＜0.05,vs the control group (n=3).圖4 細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)觀察巴佛洛霉素A1處理后的SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)HUVECs成管能力的影響

3 討論

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)外酸內(nèi)堿的狀態(tài)，而存在于生物膜上的質(zhì)子泵能夠逆濃度梯度向細(xì)胞外傳遞H＋，來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞外酸內(nèi)堿的pH值梯度，腫瘤的酸性微環(huán)境能夠刺激細(xì)胞增殖，活化轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)靶基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。然而，細(xì)胞外環(huán)境即便是輕度酸化，都會(huì)影響細(xì)胞的信號(hào)通路，從而對(duì)凋亡和增殖等產(chǎn)生一定影響。腫瘤細(xì)胞增殖到一定程度后分泌諸多淋巴生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，其中最主要為VEGF。巴佛洛霉素A1是V-ATPases的特異性抑制劑，它能夠抑制V-ATPases的活性；V-ATPases活性被抑制或者降低之后，對(duì)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)尤其是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響的報(bào)道目前尚比較少。

本研究中用巴佛洛霉素A1處理胃癌SGC-7901細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，SGC-7901細(xì)胞的V-ATPases活性被明顯抑制，細(xì)胞向外傳遞H＋的能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外的pH值梯度發(fā)生改變，SGC-7901細(xì)胞的增殖受到抑制，并引起細(xì)胞凋亡的增加。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移能力明顯降低。上述結(jié)果提示，巴佛洛霉素A1作為V-ATPases的抑制劑，能夠通過抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的V-ATPases活性，改變細(xì)胞的增殖和遷移能力。

為了進(jìn)一步探究藥物作用之后對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路或者相關(guān)因子的分泌的影響，根據(jù)本課題組前期研究的結(jié)果[11]，本研究中同樣進(jìn)行了血管生成因子的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制V-ATPases活性后，SGC-7901細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的VEGF-C的表達(dá)量也減少。同時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)上清液作用于HUVECs，結(jié)果顯示和巴佛洛霉素A1處理組培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)的HUVECs的成管能力顯著減弱。這一結(jié)果提示，V-ATPases也許能通過影響VEGF信號(hào)通路，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的遷移[15]，甚至可能會(huì)抑制新生血管的形成。其中的機(jī)制還有待通過進(jìn)一步的研究予以確認(rèn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)巴佛洛霉素A1能抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和遷移，其抑制作用可能與V-ATPases活性被抑制，引起細(xì)胞外酸性微環(huán)境的改變有關(guān)，并且涉及血管生成因子VEGF-C的表達(dá)和分泌。本研究將有助于更好地了解巴佛洛霉素A1與細(xì)胞增殖、遷移的關(guān)系，以及VEGF-C在人胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中有著重要作用，為V-ATPases抑制劑的臨床治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。