饒利棟 ，鄧雪強(qiáng)，易 軒，郝 亮

骨肉瘤也被稱為成骨肉瘤，是較為常見的骨組織腫瘤，好發(fā)于青少年及兒童[1]，在小兒骨惡性腫瘤中最為多見，約為小兒腫瘤的5%[2-3]，其惡性程度高，易發(fā)生肺部等轉(zhuǎn)移，盡管近年來手術(shù)方式和化療藥物在臨床治療方面取得了一定的進(jìn)展，但骨肉瘤預(yù)后及5 年生存率卻依舊不高，其主要原因是骨肉瘤生長迅速、早期容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4-5]。因此，我們亟需研究骨肉瘤的分子靶點(diǎn)，探討其生長迅速及早期轉(zhuǎn)移機(jī)制至關(guān)重要。

很多研究已經(jīng)表明，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，尤其在易發(fā)生轉(zhuǎn)移及惡行程度高的腫瘤中，其糖酵解水平顯著提升[6-7]。糖代謝異常是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征，賦予了腫瘤特異增殖和遷移的能力，通過為細(xì)胞提供充足的能量，可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)缺血及缺氧的耐受性，能夠避免由于氧化磷酸化受抑制而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[7-8]。研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞中糖酵解增強(qiáng)與糖酵解限速酶活性增強(qiáng)有關(guān)，6-磷酸果糖2-激酶/果糖-2，6-二磷 酸 酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase 3，PFKFB3）作為糖酵解和能量的代謝的調(diào)節(jié)者，其在乳腺癌[9]、宮頸癌[10]及肝癌[11]中高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起著關(guān)鍵性的作用。然而，在骨肉瘤中，雖然已有研究報(bào)道了PFKFB3 在骨肉瘤中表達(dá)升高，但作用機(jī)制尚未闡明[12]。

本研究中，首先證實(shí)了PFKFB3 在骨肉瘤組織中表達(dá)升高，進(jìn)一步通過沉默及過表達(dá)PFKFB3 后，在體外證實(shí)了其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的影響。進(jìn)一步對(duì)機(jī)制的研究提示，PFKFB3 可能通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）/ 蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號(hào)通路影響骨肉瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

骨肉瘤U2-OS、Saos-2、MG-63 和143B 細(xì)胞及成骨細(xì)胞hfoBI-19 均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。DMEM 培養(yǎng)液及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司，胰蛋白酶、PBS 和青霉素-鏈霉素（雙抗）均購自美國BI 公司，細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自美國Next 公司。RIPA 裂解液、蛋白抽提試劑盒和BCA 檢測(cè)試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，電化學(xué)發(fā)光試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。兔抗人PFKFB3（貨號(hào)：ab181861）、波形蛋白（Vimentin）（貨號(hào)：ab92547）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）（貨號(hào)：ab40772）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）（貨號(hào)：76011）、E盒結(jié)合鋅指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2，ZEB2）（貨號(hào)：ab138222）、PI3K、磷酸化PI3K（phospho-PI3K，p-PI3K）、AKT、磷酸化AKT（phospho-AKT，p-AKT）和GAPDH（內(nèi)參照）（貨號(hào)：ab181602）單克隆抗體，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（貨號(hào)：ab6734）均購自英國Abcam 公司。染色試劑EdU 和Hoechst33342 購自廣州市銳博生物科技有限公司，CCK-8 檢測(cè)試劑盒購自日本同仁株式會(huì)化學(xué)研究所，凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD 公司。反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa 公司，PCR 引物由廣州市銳博生物科技有限公司合成。PI3K 抑制劑LY294002 購自美國MCE 公司。

流式細(xì)胞儀及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)：7500 ABI）為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品，熒光顯微鏡為上海五相儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.2 組織標(biāo)本

共收集36 例骨肉瘤組織及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，每例組織都經(jīng)病理診斷為骨肉瘤及癌旁正常非癌組織，后續(xù)應(yīng)用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。部分組織標(biāo)本經(jīng)4%中性多聚甲醛溶液固定后，制作切片；余下組織均于－80 ℃保存。本研究獲南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)骨肉瘤組織中PFKFB3 mRNA 的表達(dá)水平

36 對(duì)骨肉瘤組織及其相應(yīng)的癌旁組織經(jīng)液氮處理后碾磨粉碎，每100 mg 組織中加入1 mL TRIzol 試劑，用勻漿器勻漿處理后，加入1 mL的氯仿，離心后取上清液并加入500 μL 異丙醇，離心后除去上清液，用75%的乙醇溶液洗滌沉淀；沉淀干燥后加入50 μL ddH2O 溶解提取獲得的總RNA，采用分光光度計(jì)測(cè)量抽提獲得的總RNA濃度。取適量總RNA 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以此cDNA 為模板，進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。PCR 擴(kuò)增條件為94 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min、72 ℃ 1 min，共30 個(gè)循環(huán)。以－2ΔΔCt值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

PFKFB3 基因的上游引物序列為5’-GATGCCCTTCAGGAAAGCCT-3’，下游引物序列為5’-TTGAACACTTTTGTGGGGACGC-3’；GAPDH基因的上游引物序列為5’-CCTGCCGGTGACTAACCCTG-3’，下游引物序列為5’-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTG-3’。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)骨肉瘤組織及細(xì)胞中PFKFB3 蛋白的表達(dá)水平

收集骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、Saos-2，MG-63、143B 及成骨細(xì)胞hfoBI-19，以及36 對(duì)骨肉瘤及其相應(yīng)的癌旁組織（組織標(biāo)本用液氮處理后，在液氮中碾磨粉碎），加入RIPA 蛋白裂解液，離心后收集細(xì)胞上清液，即為提取獲得的組織及細(xì)胞中的總蛋白。采用BCA 法測(cè)量蛋白濃度，每個(gè)上樣孔加入50 μg（10 μL）總蛋白，行10% SDS-PAGE 分離蛋白；將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含5% 脫脂奶粉的封閉液封閉處理，加入一抗[ 兔抗人PFKFB3單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）和兔抗人GAPDH 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶3 000）]4 ℃孵育過夜；洗膜后加入二抗[HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶5 000）]孵育1 h，洗膜后滴入電化學(xué)發(fā)光試劑，最后利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀器觀察骨肉瘤組織及細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況。以目的蛋白條帶與內(nèi)參照GAPDH 蛋白條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)骨肉瘤組織中PFKFB3蛋白的表達(dá)情況

選取25 例骨肉瘤及其癌旁組織標(biāo)本，經(jīng)石蠟固定、包埋、切片（4 μm）及脫蠟等步驟后，滴加一抗[ 兔抗人PFKFB3 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶200）]孵育過夜，加入二抗[HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶2 000）]孵育處理2 h，DAB 顯色后并行蘇木精復(fù)染。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，并根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，未著色為0分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；同時(shí)計(jì)算每張切片各視野中陽性細(xì)胞所占的百分比，無陽性細(xì)胞為0 分，陽性細(xì)胞所占的百分比＜10% 為1 分，10%～50% 為2分，50%～80% 為3 分，80%～100% 為4 分；將二者分值相乘，0～3 分為陰性，4～6 分為弱陽性，7～9 分為中陽性，9～12 分為強(qiáng)陽性。

1.6 PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞的構(gòu)建

以攜帶特異性針對(duì)人PFKFB3 基因的shRNA（shPFKFB3）（shPFKFB3序列為5’-TTGAGAGATGTCAAAGCT-3’）重組慢病毒載體感染U2-OS 細(xì)胞，構(gòu)建PFKFB3 低表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞；以shRNA-陰性對(duì)照（negative control，NC）（shNC）為對(duì)照組。以攜帶有人PFKFB3 全基因的重組慢病毒感染Saos-2 細(xì)胞，構(gòu)建PFKFB3 過表達(dá)（overexpression，OE）的骨肉瘤細(xì)胞（OEPFKFB3），以空載體（Vector）為對(duì)照組。所有重組慢病毒的構(gòu)建及感染均由上海吉瑪生物有限公司完成。分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（實(shí)驗(yàn)流程同1.3 節(jié)）和蛋白質(zhì)印跡法（實(shí)驗(yàn)流程同1.4節(jié)）檢測(cè)PFKFB3 mRNA 和蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中沉默或過表達(dá)的情況。

1.7 CCK-8 法和EdU 法檢測(cè)PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長期的骨肉瘤U2-OS 和Saos-2 細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)分組同1.6 節(jié)），經(jīng)胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板中，分別于培養(yǎng)0、24、48 和72 h 時(shí)每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)37 ℃孵育2 h 后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長450 nm 處檢測(cè)各孔的D值，并繪制生長曲線。

EdU 法檢測(cè)，按試劑盒操作說明，每孔加入100 μL 含EdU 的培養(yǎng)液，置于37 ℃孵育2 h；加入100 μL 4% 多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min；然后加入100 μL 甘氨酸，再加入100 μL Apollo 和100 μL 0.5% Triton-X 通 透細(xì)胞；用PBS 洗滌細(xì)胞2 次；再加入100 μL Hoechst33342 避光處理10 min，室溫下置于搖床上脫色30 min；用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，在熒光顯微鏡下（放大倍數(shù)為200 倍）觀察細(xì)胞的增殖情況。

1.8 FCM 法檢測(cè)PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長期的骨肉瘤U2-OS 和Saos-2 細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)分組同1.6 節(jié)），經(jīng)胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)細(xì)胞/ 孔的密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，每孔分別加入FITC-Annexin Ⅴ及碘化丙啶（propidium iodide，PI）各5 μL，暗室孵育15 min 后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各孔細(xì)胞的凋亡率。

1.9 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響

收集對(duì)數(shù)生長期的骨肉瘤U2-OS 和Saos-2細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)分組同1.6 節(jié)），經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液備用，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6 孔板中，待細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)板底部后，用200 μL 的槍頭進(jìn)行劃痕處理；用PBS 沖洗脫落的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，最后在光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為200 倍）進(jìn)行拍照，并計(jì)算劃痕寬度所占的百分比（采用Imagej 軟件計(jì)算劃痕的面積隨著時(shí)間的變化，以及傷口愈合的百分比）。

1.10 Transwell 小室法檢測(cè)PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響

取基質(zhì)膠（10 mg/mL）加入PBS 稀釋后（PBS：基質(zhì)膠體積比例為1 ∶3），取50 μL 鋪設(shè)在上室膜上。收集對(duì)數(shù)生長期的骨肉瘤U2-OS 和Saos-2 細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)分組同1.6 節(jié)），經(jīng)胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液備用；Transwell 小室下室中加入500 μL 含10% FBS 的培養(yǎng)液，然后接種2×104個(gè)細(xì)胞。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，取出小室，PBS 清洗2 遍，輕輕的用棉簽將未穿過小室膜的細(xì)胞擦去；用甲醇溶液固定細(xì)胞20 min，1%結(jié)晶紫染色30 min，自然風(fēng)干；光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)（放大倍數(shù)為200 倍），并拍照計(jì)數(shù)。

1.11 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及PI3K/AKT 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

收集對(duì)數(shù)生長期的骨肉瘤U2-OS 和Saos-2細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)分組同1.6 節(jié)），抽提細(xì)胞蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 和ZEB2，以及PI3K/AKT 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白PI3K、p-PI3K、AKT 和p-AKT的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)流程同1.4 節(jié)。其中一抗為兔抗人PFKFB3、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、ZEB2、PI3K、p-PI3K、AKT 和p-AKT 單克隆抗體，以GAPDH 為內(nèi)參照。

1.12 PI3K 抑制劑LY294002 對(duì)PFKFB3 高表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲以及PI3K/AKT 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

有研究報(bào)道提示，肝癌中PFKFB3 能夠影響AKT 的磷酸化進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移[13]。PFKFB3 是否可能通過調(diào)控PI3K/AKT的磷酸化進(jìn)而影響骨肉瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，因此本研究中選取穩(wěn)定高表達(dá)PFKFB3 的骨肉瘤Saos-2 細(xì)胞，用PI3K 抑制劑LY294002 處理后，檢測(cè)其對(duì)PFKFB3 過表達(dá)Saos-2 細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響。

選取穩(wěn)定高表達(dá)PFKFB3 的骨肉瘤Saos-2 細(xì)胞，收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為3 組：對(duì)照組（Vector）、PFKFB3 過 表 達(dá) 組（OE-PFKFB3）和OEPFKFB3 ＋LY294002 組[PFKFB3過表達(dá)的Saos-2 細(xì)胞中加入PI3K 抑制劑LY294002（10 μmol/L）處理24 h]。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LY294002 處理后對(duì)Saos-2 細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平（實(shí)驗(yàn)流程同1.4節(jié)），隨后分別采用CCK-8法（實(shí)驗(yàn)流程同1.7節(jié)）、FCM 法（實(shí)驗(yàn)流程同1.8 節(jié)）和Transwell 小室法（實(shí)驗(yàn)流程同1.10 節(jié)）檢測(cè)對(duì)Saos-2 細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響，

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采 用SPSS19.0 和GraphPad Prism7.0 數(shù) 據(jù)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有研究均獨(dú)立重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示。多組間均數(shù)比較首先采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFKFB3 在骨肉瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況

為分析PFKFB3 在骨肉瘤中的表達(dá)情況，本研究中首先采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了36 例骨肉瘤組織及其相應(yīng)的癌旁組織中PFKFB3 mRNA 及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，骨肉瘤組織及其相應(yīng)的癌旁組織中PFKFB3 mRNA（圖1A）及蛋白（圖1B）的表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P值均＜0.01）。

采用免疫組織化學(xué)法分析了25 例骨肉瘤及其相應(yīng)的癌旁組織中PFKFB3 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果（圖1C）顯示，25 例骨肉瘤組織中PFKFB3蛋白高表達(dá)的為19 例（19/25，76%），癌旁組織中僅有4 例高表達(dá)（4/25，16%）。

進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞系（U2-OS、Saos-2、MG-63 和143B）和正常成骨細(xì)胞hfoBI-19 中PFKFB3 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在U2-OS、Saos-2、MG-63 和143B 細(xì)胞中PFKFB3 mRNA（圖1D）及蛋白（圖1E）的表達(dá)明顯高于正常成骨細(xì)胞hfoBI-19。

上述結(jié)果表明，PFKFB3 在骨肉瘤組織及細(xì)胞中表達(dá)升高。其中以U2-OS 細(xì)胞中PFKFB3 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平最高，而Saos-2 細(xì)胞中PFKFB3 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平最低，因此后續(xù)通過沉默U2-OS 細(xì)胞中PFKFB3 基因的表達(dá)水平，過表達(dá)Saos-2 細(xì)胞中PFKFB3 基因的表達(dá)水平來研究PFKFB3 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PFKFB3 mRNA 和蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中沉默或過表達(dá)的情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)結(jié)果（圖2A）顯示，感染攜帶有shPFKFB3 的重組慢病毒后，U2-OS 細(xì)胞中PFKFB3 mRNA 的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01）；感染攜帶有OE-PFKFB3 的重組慢病毒后，Saos-2 細(xì)胞中PFKFB3 mRNA的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.01）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖2B）同樣顯示，感染攜帶有shPFKFB3 的重組慢病毒后，U2-OS細(xì)胞中PFKFB3 蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)；感染攜帶有OE-PFKFB3 的重組慢病毒后，Saos-2 細(xì)胞中PFKFB3 蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.01）。

Fig.1 The expression level of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3 (PFKFB3) was up-regulated in osteosarcoma tissues and cells.Detected the expression levels of PFKFB3 mRNA and protein in 36 cases of osteosarcoma and adjacent tissues by real-time fluorescent quantitative PCR (A),Western blotting (B) and immunohistochemistry (C),as well as PFKFB3 mRNA (D) and protein (E) in osteosarcoma U2-OS,Saos-2,MG-63 and 143B cells and osteoblast hfoBI-19 cells (as control).T: Tumor tissue;NT: Non-tumor tissue.**P＜0.01 (n=3).圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PFKFB3 mRNA 和蛋白在骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平

Fig.2 The expression levels of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3 (PFKFB3) mRNA and protein in osteosarcoma U2-OS and Saos-2 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (A) and Western blotting (B),respectively.ShNC:The U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying negative control (NC) shRNA;ShPFKFB3:U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying shRNA targeting PFKFB3 gene;Vectoe:Saos-2 cells were infected with empty lentiviral vector;OE-PFKFB3:Saos-2 cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying the full PFKFB3 gene;PFKFB3 was down-regulated in U2-OS cells;PFKFB3 was up-regulated in Saos-2 cells;**P＜0.01,vs shNC group or Vector group (n=3).圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（A）和蛋白質(zhì)印跡法（B）檢測(cè)PFKFB3 mRNA 和蛋白在骨肉瘤U2-OS 和Saos-2 細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.3 PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 法（圖3A）及EdU 法（圖3B）檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默PFKFB3 基因表達(dá)后，U2-OS 細(xì)胞的增殖被抑制（P＜0.05 和P＜0.01）；反之PFKFB3 基因過表達(dá)后，與對(duì)照組相比，Saos-2 細(xì)胞增殖能力明顯提高（P值均＜0.05）。這一結(jié)果表明，PFKFB3 能夠促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長。

Fig.3 The proliferation of osteosarcoma U2-OS cells 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3 (PFKFB3) gene silencing and Saos-2 cellsP FKFB3 gene overexpressing was detected by CCK-8 assay (A) and EdU method (B),respectively.ShNC:U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying negative control (NC) shRNA;ShPFKFB3:U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying shRNA targetingP FKFB3 gene;Vector:Saos-2 cells were infected with empty lentiviralvector;OE-PFKFB3:Saos-2cellswereinfected with recombinant lentiviral vector carrying the fullP FKFB3 gene.**P＜0.01,vs shNCgroup;P*＜0.05,vs Vector group(n=3).圖3 分別采用CCK-8 法（A）和EdU 法（B）檢測(cè)PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤U2-OS 和Saos-2 細(xì)胞增殖的影響

2.4 PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響

FCM 法檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，在沉默PFKFB3 表達(dá)的U2-OS 細(xì)胞中，其凋亡率較對(duì)照組明顯提高（P＜0.01）；相反，在PFKFB3 過表達(dá)的Saos-2 的細(xì)胞中，其凋亡率較對(duì)照組被明顯抑制（P＜0.05）。這一結(jié)果表明，PFKFB3 能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。

2.5 PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響及可能的作用機(jī)制

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（圖5A）顯示，在沉 默PFKFB3 表達(dá)的U2-OS細(xì)胞中，24 h 時(shí)其劃痕寬度較對(duì)照組寬（P＜0.05）；相反，在PFKFB3 過表達(dá)的Saos-2 的細(xì)胞中，24 h 時(shí)其劃痕寬度較對(duì)照組窄（P＜0.05）。

Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（圖5B）顯示，在沉默PFKFB3 表達(dá)的U2-OS 細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，24 h 時(shí)其穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）；相反，在PFKFB3 過表達(dá)的Saos-2 的細(xì)胞中，24 h 時(shí)其穿過小室膜的細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加（P＜0.01）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖5C）進(jìn)一步顯示，在沉默PFKFB3 表達(dá)的U2-OS 細(xì)胞中，Vimentin、N-cadherin 和ZEB2蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯下調(diào)，而E-cadherin 蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)；相反，在PFKFB3 過表達(dá)的Saos-2的細(xì)胞中，Vimentin、N-cadherin 和ZEB2 蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯上調(diào)，而E-cadherin 蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)。

Fig.4 The apoptosis rate of osteosarcoma U2-OS cells 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3(PFKFB3) gene silencing and Saos-2 cells PFKFB3 gene overexpressing were detected by FCM method.ShNC:U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying negative control (NC) shRNA;ShPFKFB3:U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying shRNA targeting PFKFB3 gene;Vector:Saos-2 cells were infected with empty lentiviral vector;OE-PFKFB3:Saos-2 cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying the full PFKFB3 gene.**P＜0.01,vs shNC group;*P＜0.05,vs Vector group (n=3).圖4 FCM 法檢測(cè)PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤U2-OS 和Saos-2 細(xì)胞凋亡的影響

Fig.5 The migration and invasion abilities of osteosarcoma U2-OS cells 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3 (PFKFB3) gene silencing and Saos-2 cells PFKFB3 gene overexpressing were detected by wound healing assay (A) and Transwell chamber invasion test (B),respectively.The expression levels of Vimentin,E-cadherin,N-cadherin,E-box binding zinc finger protein 2 (ZEB2) proteins were detected by Western blotting (C). ShNC:U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying negative control (NC) shRNA;ShPFKFB3:U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying shRNA targeting PFKFB3 gene;Vector:Saos-2 cells were infected with empty lentiviral vector;OE-PFKFB3:Saos-2 cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying the full PFKFB3 gene.*P＜0.05,**P＜0.01,vs shNC group or Vector group (n=3).圖5 分別采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)（A）和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)（B）檢測(cè)PFKFB3 基因沉默或過表達(dá)對(duì)骨肉瘤U2-OS 和Saos-2細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響并用蛋白印跡法（C）檢測(cè)對(duì)Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 和ZEB2 蛋白表達(dá)水平的影響

上述結(jié)果表明，PFKFB3 能夠正向調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

2.6 PFKFB3 通過調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路的磷酸化水平影響骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果（圖6A）顯示，在沉 默PFKFB3表達(dá)的U2-OS細(xì)胞中，PI3K 和AKT 蛋白的表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，p-PI3K和p-AKT 蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯下調(diào)；在PFKFB3過表達(dá)的Saos-2 細(xì)胞中，PI3K 和AKT 蛋白的表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，p-PI3K和p-AKT 蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯上調(diào)。進(jìn)一步對(duì)PFKFB3 過表達(dá)的Saos-2 細(xì)胞用PI3K抑制劑LY294002 處理后，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果證實(shí)了PI3K 和AKT 及其磷酸化蛋白p-PI3K 和p-AKT 表達(dá)水平均被明顯下調(diào)。

Fig.6 The expression level of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3 (PFKFB3),phosphoinositide 3-kinase (PI3K),phospho-PI3K (p-PI3K),protein kinase B (PBK,also known as AKT) and p-AKT proteins in osteosarcoma U2-OS cells PFKFB3 gene silencing,Saos-2 cells PFKFB3 gene overexpressing and Saos-2 cells PFKFB3 gene overexpressing treatment with PI3K inhibitor LY294002 (10 mmol/L) were detected by Western blotting (A).The proliferation,apoptosis rate and invasion of Saos-2 cells were detected by Western blotting,CCK-8 method,FCM method and Transwell chamber invasion test.ShNC:U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying negative control (NC) shRNA;ShPFKFB3:U2-OS cells were infected with recombinant lentiviral vector carrying shRNA targeting PFKFB3 gene;Vector:Saos-2 cells were infected with empty lentiviral vector;OE-PFKFB3:Saos-2 cells were infected with recombinantlentiviral vector carrying thefullPFKFB3 gene;OE-PFKFB3+LY294002:Saos-2 cellsP FKFB3 gene overexpressingweretreatedwith PI3K inhibitorLY294002 (10 μmol/L).*P＜0.05,**P＜0.01(n=3).圖6 分別采用蛋白質(zhì)印跡法（A）、CCK-8 法（B）、FCM 法（C）和Transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn)（D）檢測(cè)PI3K抑制劑LY294002 對(duì)PFKFB3 過表達(dá)Saos-2 細(xì)胞中PI3K/AKT 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響以及對(duì)Saos-2細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響

CCK-8 法 檢 測(cè) 結(jié)果（圖6B）顯 示，LY294002 處理組Saos-2 細(xì)胞的增殖能力較未用LY294002 處理組（僅為PFKFB3 過表達(dá)的Saos-2 細(xì)胞）明顯降低（P＜0.05）。FCM 法檢測(cè)結(jié)果（圖6C）顯示，LY294002 處理組Saos-2細(xì)胞的凋亡率較未用LY294002 處理組明顯提高（P＜0.05）。Transwell 小室法檢測(cè)結(jié)果（圖6D）顯示，LY294002 處理組Saos-2 細(xì)胞的侵襲能力較未用LY294002 處理組明顯降低（P＜0.05）。

上述結(jié)果表明，PFKFB3 通過調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路的磷酸化進(jìn)而影響骨肉瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移。

3 討論

骨肉瘤嚴(yán)重影響青少年的健康，由于其惡性程度高，早期即能轉(zhuǎn)移至肺等組織[3,14]，盡管當(dāng)前外科截肢手術(shù)及化療藥物不斷發(fā)展，但骨肉瘤的5 年預(yù)后卻依舊徘徊不前，在當(dāng)前免疫治療尚未成熟及新型化療藥物發(fā)現(xiàn)之前，亟需進(jìn)一步探尋骨肉瘤生長及轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)，為骨肉瘤的靶向治療提供更多的科學(xué)依據(jù)。

研究表明，在易于轉(zhuǎn)移及生長迅速的腫瘤中糖酵解顯著增加[15]。作為糖酵解中關(guān)鍵酶的重要亞型，PFKFB3 在增強(qiáng)和協(xié)同糖酵解中起著重要作用，研究已經(jīng)證實(shí)PFKFB3 與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移之間存在關(guān)聯(lián)[16-17]。PENG 等[18]研究證實(shí)乳腺癌中PFKFB3 表達(dá)升高，沉默乳腺癌細(xì)胞中PFKFB3 的表達(dá)水平后能顯著抑制其生長和轉(zhuǎn)移能力。另外研究者也證實(shí)了骨肉瘤中PFKFB3 的表達(dá)與骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)[19]，但其在腫瘤中具體機(jī)制尚不完全清楚，因此探索其分子機(jī)制對(duì)腫瘤的靶向治療尤為重要。當(dāng)前有研究報(bào)道認(rèn)為，腫瘤中第10 號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶基因和張力蛋白（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）基因的缺失、Ras 及AKT 的激活會(huì)增加糖酵解中的限速酶PFKFB3 的活性；另外PFKFB3 對(duì)于含有Ras 轉(zhuǎn)化細(xì)胞腫瘤的生長十分重要，能夠促進(jìn)正常的血管生成和腫瘤的生長，并加速腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[20]。此外有研究證實(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和p38/MK2 信號(hào)通路的激活及PFKFB3 第461 位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化可使其表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移[21]。

然而在骨肉瘤中，雖然當(dāng)前已有研究者報(bào)道了PFKFB3 作為微RNA 和環(huán)狀RNA 的靶點(diǎn)調(diào)控骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移[12,22]，但尚未有研究報(bào)道其在骨肉瘤中的作用機(jī)制。本研究證實(shí)了，PFKFB3 在骨肉瘤中高表達(dá)，功能上PFKFB3 能夠促進(jìn)骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移并抑制其凋亡，機(jī)制上證實(shí)了PFKFB3 通過影響PI3K/AKT 信號(hào)通路的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)骨肉瘤的生長及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明PFKFB3 能夠促進(jìn)骨肉瘤的生長和轉(zhuǎn)移，以期為骨肉瘤的靶向治療提供更多的理論依據(jù)。