王鑫蓉，王 哲，楊向紅

乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤，乳腺浸潤性導管癌是乳腺癌中最常見的類型，約占乳腺癌病例的80%[1]。近年來，隨著乳腺腫瘤篩查技術(shù)的普及，越來越多的早期腫瘤被發(fā)現(xiàn)，并通過采用手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等多種治療方式，很大程度上阻礙或延緩了乳腺癌的進展，但乳腺癌的分子生物學機制目前尚未完全闡明，乳腺癌仍存在較高的復發(fā)和轉(zhuǎn)移風險。因此，明確乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，尋找相關(guān)的生物標志物和治療靶點對乳腺癌診治十分重要。研究發(fā)現(xiàn)，嘌呤類受體在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用，嘌呤類受體包括腺苷激活的P1受體和細胞外ATP激活的P2受體2大類，P2受體又可分為離子門控型P2X受體和G蛋白耦聯(lián)型P2Y受體。P2X受體包括P2X1～P2X7共7個亞型[2]，其中P2X7受體（P2X7 purinergic receptor，P2X7R）作為P2X受體家族中的一員，具有促進腫瘤增殖、遷移和侵襲等作用[3-4]。目前已證實，P2X7R在乳腺癌中高表達[5]，并且P2X7R影響乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的機制也逐漸明確，但目前關(guān)于P2X7R在乳腺癌預后方面的研究鮮見報道。本研究從臨床研究的角度出發(fā)，用免疫組織化學法檢測P2X7R在乳腺浸潤性導管癌、導管原位癌和乳腺癌旁正常組織中的表達情況，分析P2X7R與乳腺浸潤性導管癌臨床病理指標的關(guān)系并評估P2X7R的預后價值。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選取2015年1月—2015年12月中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院臨床資料齊全的乳腺浸潤性導管癌石蠟標本170例，所有患者均行乳腺癌根治術(shù)，且術(shù)前均未接受放療、化療和內(nèi)分泌治療等。患者年齡范圍為25～82歲，平均年齡52.7歲，中位年齡53歲。按乳腺癌病理分級Ⅰ級10例、Ⅱ級137例和Ⅲ級23例；按照美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）

第8版[6]TNM分期標準，Ⅰ期55例、Ⅱ期91例和Ⅲ期24例。本研究為保證預后信息的準確性，未納入術(shù)前有遠處轉(zhuǎn)移的Ⅳ期乳腺癌患者。同時選取經(jīng)病理診斷的50例乳腺導管原位癌和34例癌旁正常組織作為對照。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

兔抗人P2X7R多克隆抗體（NBP1-32470）購自美國Novus Biologicals公司；鼠兔通用二步法檢測試劑盒（PV-9000）和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；組織切片機和光學顯微鏡購自德國Leica公司。

1.3 免疫組織化學法檢測

將石蠟組織切片置于新鮮的二甲苯溶液中脫蠟20 min，隨后經(jīng)100%、95%和75%的乙醇溶液梯度各水化5 min，再行用自來水沖洗5 min；將組織切片置于pH＝6.0的檸檬酸鹽修復液中，使用高壓鍋隔水加熱至排氣后保持5 min進行抗原修復，冷卻后用PBS沖洗切片；滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗切片；滴加一抗兔抗人P2X7R多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500），于4 ℃冰箱孵育過夜；次日，復溫后用PBS沖洗切片；滴加PV-9000反應(yīng)增強液，室溫孵育20 min，PBS沖洗切片；最后滴加二抗（辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠/兔IgG），室溫孵育20 min，PBS沖洗切片；滴加新鮮配制的DAB顯色液，在光學顯微鏡下控制顯色程度后行水洗，蘇木素復染后再次水洗；風干后用中性樹膠封固。用PBS替代一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判讀

P2X7R主要表達在細胞膜上和（或）細胞質(zhì)中，陽性呈棕黃色或黃色。盲法重復3次進行結(jié)果判讀，用免疫組織化學評分來評價P2X7R的表達水平。按染色強度評分：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按腫瘤陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比評分：＜10%為0分，10%～25%為1分，26%～70%為2分，＞70%為3分。兩者評分相乘即為免疫組織化學評分：其范圍為0～9分，＜4分為低表達組，≥4分為高表達組。此評分標準被廣泛采納用于各項研究中[7-9]。

同樣用免疫組織化學法進行檢測，發(fā)現(xiàn)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、p53和Ki-67均表達于細胞核上，各蛋白在細胞核上呈棕黃色即為陽性細胞。ER和PR陽性為腫瘤陽性細胞所占百分比≥1%；p53陽性為腫瘤陽性細胞所占百分比≥10%；Ki-67陽性為腫瘤陽性細胞所占百分比＞14%。人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）定位于細胞膜上，陽性為細胞膜呈棕黃色，根據(jù)乳腺癌HER-2檢測指南（2019版）為標準，HER-2的判讀應(yīng)先參考免疫組織化學法檢測結(jié)果：0和1＋（＋）為陰性，3＋（＋＋＋）為陽性，2＋（＋＋）需進一步行熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）檢測，若FISH檢測結(jié)果提示HER-2基因擴增，即為陽性。

1.5 隨訪

所納入的乳腺浸潤癌患者共有170例，在手術(shù)之后以電話、電子病歷或輔助檢查等方式進行追蹤，其中失訪15例，隨訪率為91.2%，隨訪時間6～65個月，中位隨訪時間為57個月?？偵妫╫verall survival，OS）時間定義為從患者腫瘤確診至死亡或隨訪截止的時間，無病生存（disease-free survival，DFS）時間定義為從患者手術(shù)日起至疾病復發(fā)、轉(zhuǎn)移或患者死亡所間隔的時間。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。采用χ2檢驗分別比較乳腺浸潤性導管癌組織與導管原位癌組織和乳腺癌旁正常組織中的陽性率差異；并用χ2檢驗分析P2X7R表達水平與臨床病理指標的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier法及l(fā)ogrank檢驗進行生存分析；GraphPad Prism8.0軟件繪制生存曲線；采用COX回歸模型進行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 P2X7R在乳腺癌組織中的表達水平

免疫組織化學法檢測結(jié)果（圖1）顯示，P2X7R主要表達在細胞質(zhì)和（或）細胞膜上，在乳腺浸潤性導管癌中P2X7R高表達者111例，高表達率為65.3%（111/170）；在乳腺導管原位癌中P2X7R高表達者31例，高表達率為62.0%（31/50）；在乳腺癌旁正常組織高表達者6例，高表達率為17.6%（6/34）。浸潤性導管癌與導管原位癌的高表達率相比，差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.183，P＞0.05）；浸潤性導管癌同乳腺癌旁正常組織的高表達率相比，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝26.298，P＜0.01）（表1）。上述結(jié)果提示，P2X7R在乳腺浸潤性導管癌和導管原位癌組織中高表達，在乳腺癌旁正常組織中低表達。

Fig.1 The HE staining result of invasive ductal carcinoma (A,×200) and the P2X7 purinergic receptor(P2X7R) expression in invasive ductal carcinoma (B-C),ductal carcinoma in situ (D-E) and paracancerous normal (F) tissues were detected by immunohistochemical staining (DAB staining,×200).B:High expression of P2X7R in invasive ductal carcinoma;C:Low expression of P2X7R in invasive ductal carcinoma;D:High expression of P2X7R in ductal carcinoma in situ;E:Low expression of P2X7R in ductal carcinoma in situ;F:Low expression of P2X7R in para-cancerous tissue.圖1 乳腺浸潤性導管癌的HE染色結(jié)果（A）和免疫組織化學法檢測P2X7R在乳腺浸潤性導管癌（B～C）、導管原位癌（D～E）和乳腺癌旁正常組織（F）中的表達水平

2.2 P2X7R表達水平與臨床病理指標的相關(guān)性

對乳腺浸潤性導管癌患者的臨床病理參數(shù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中P2X7R表達水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.039）、TNM分期（P＝0.045）、ER（P＝0.024）和PR（P＝0.033）存在相關(guān)性，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期、ER陽性和PR陽性患者中P2X7R高表達率更高。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中P2X7R高表達率為73.68%（56/76），高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者的58.51%（55/94）；TNM分期Ⅲ期患者中P2X7R高表達率為83.33%（20/24），高于Ⅰ＋Ⅱ期患者的62.33%（91/146）；ER陽性患者中P2X7R高表達率為72.63%（69/95），高于ER陰性患者的56.00%（42/75）；PR陽性患者中P2X7R高表達率為72.53%（66/91）高于PR陰性患者的56.96%（45/79）。P2X7R表達與患者年齡、腫瘤大小、組織學分級、HER-2、p53和Ki-67表達均無相關(guān)性。

2.3 P2X7R表達對乳腺浸潤性導管癌患者預后的影響

本研究隨訪截止日期為2020年6月。170例患者中，發(fā)生骨轉(zhuǎn)移、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移或（伴）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例，皮膚轉(zhuǎn)移者1例，同側(cè)胸壁復發(fā)5例，對側(cè)乳房復發(fā)12例，其中因復發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡10例。

用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗分析P2X7R表達與乳腺浸潤性導管癌患者OS和DFS時間的關(guān)系，結(jié)果顯示P2X7R高表達患者OS時間較低表達患者短，但差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.099）（圖2A）；P2X7R高表達患者DFS時間較低表達患者短，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.013）（圖2B）。進一步對影響乳腺浸潤性導管癌DFS時間的各個因素進行分析，在單因素分析中，腫瘤大?。≒＝0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.009）、TNM分期（P＜0.001）、Ki-67（P＝0.026）和P2X7R表達水平（P＝0.013）與患者DFS時間顯著相關(guān)，是影響乳腺浸潤性導管癌患者DFS的危險因素。

COX多因素分析結(jié)果（表3）顯示，TNM分期和P2X7R表達水平是乳腺浸潤性導管癌患者DFS的獨立預后因素。P2X7R高表達患者的不良預后風險是低表達患者的2.742倍。

表1 P2X7R在乳腺浸潤性導管癌、導管原位癌和乳腺癌旁正常組織中的表達水平Table 1 The expression of P2X7 purinergic receptor (P2X7R) in invasive ductal carcinoma,ductal carcinoma in situ and para-cancerous tissues n (%)

表2 P2X7R與乳腺浸潤性導管癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 Relationship between the expression of P2X7 purinergic receptor (P2X7R) and clinicopathological features of breast invasive ductal carcinoma[N＝170,n (%)]

Fig.2 Kaplan-Meier plot for breast invasive ductal carcinoma patients with different expression of P2X7 purinergic receptor (P2X7R).A:Overall survival (OS) curves of breast invasive ductal carcinoma patients according to the P2X7R expression (P=0.099);B:Disease-free survival (DFS) curves of breast invasive ductal carcinoma patients according to the P2X7R expression (P=0.013).圖2 Kaplan-Meier法分析P2X7R表達水平與乳腺浸潤性導管癌患者OS（A）和DFS（B）時間的關(guān)系

表3 影響乳腺浸潤性導管癌DFS時間的單因素和多因素分析結(jié)果Table 3 The univariate and multivariate analyses of disease-free survival (DFS) in the patients with breast invasive ductal carcinoma

3 討論

乳腺癌是女性高發(fā)的癌癥，其治療和預后受到廣泛關(guān)注。乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、組織學分級、TNM分期、ER、PR、HER-2、p53和Ki-67等的表達水平在一定程度上影響了乳腺癌的治療和預后。研究表明，乳腺癌與許多分子標志物密切相關(guān)，尋找乳腺癌的治療靶點是目前的研究熱點。P2X7R作為P2X受體家族中的一員，是嘌呤P2受體家族最獨特的亞型[10]。ATP是P2X7R的天然配體，組織損傷、炎性反應(yīng)和腫瘤等組織的微環(huán)境中ATP濃度升高，可刺激P2X7R活性上調(diào)，通過激活磷脂酶D（phospholipase D，PLD），促 進血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達從而增加腫瘤血管的生成[11]。P2X7R還可上調(diào)精氨酸酶-1（arginase-1，ARG-1），轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）及活性氧（reactive oxygen species，ROS）等的表達，從而促進腫瘤的生長[3]。P2X7R主要參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路[12]，其下游通路包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38MAPK）通路、c-Jun氨基末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase，JNK/SAPK）通路等3條信號通路。參與ERK通路引起核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的產(chǎn)生從而促進細胞的增殖和侵襲[4]；通過激活凋亡相關(guān)蛋白caspase-1的表達，從而激活p38MAPK信號通路，促進乳腺癌的惡性進展；有研究證實，應(yīng)用p38MAPK抑制劑可使p38MAPK蛋白水平降低，阻斷其促進細胞增殖的效應(yīng)，并引發(fā)乳腺癌耐藥細胞凋亡[13]；同時P2X7R參與JNK/SAPK信號通路引起c-Jun蛋白的磷酸化促進腫瘤細胞凋亡[14]。P2X7R還可通過蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路降低乳腺癌細胞中E-鈣黏蛋白的表達，并刺激基質(zhì)金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13）分泌從而促進乳腺癌的侵襲和遷移[15]。據(jù)最新文獻報導，BRISSON等[16]通過建立小鼠乳腺癌模型，證實P2X7R促進小鼠乳腺癌細胞的侵襲性和腫瘤進展，并且使用P2X7R拮抗劑治療小鼠乳腺癌是有效的，提出了P2X7R是乳腺癌抗癌治療靶點的觀點。

研究表明，P2X7R的表達具有多樣性，在宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌組織中呈現(xiàn)低表達，發(fā)揮P2X7R的促凋亡作用，而在乳腺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌和神經(jīng)母細胞瘤等組織中的表達明顯上調(diào)，發(fā)揮其促增殖作用。本研究結(jié)果表明，P2X7R在乳腺癌中高表達，這與JUBB等[5]的研究結(jié)果相一致，同時發(fā)現(xiàn)P2X7R在導管原位癌階段也呈現(xiàn)高表達，說明P2X7R在乳腺癌腫瘤的早期就已經(jīng)發(fā)揮其作用，提示P2X7R不僅能促進腫瘤生長，也可能有致癌作用。以往的研究未曾探討過P2X7R與乳腺癌臨床病理指標的關(guān)系及其預后價值，本研究發(fā)現(xiàn)P2X7R與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期、ER和PR表達水平相關(guān)。另外有研究指出，ER可調(diào)控P2X7R表達，ER與P2X7R表達呈正相關(guān)，可促進腫瘤的增殖[17]，這與本研究的分析結(jié)果一致。同時本研究發(fā)現(xiàn)，P2X7R高表達的乳腺癌患者較低表達患者DFS時間更短，預后更差，術(shù)后可能更易出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移。而在結(jié)直腸癌中，有研究指出P2X7R高表達的患者其生存期更短，預后更差，且P2X7R的表達也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和TNM分期相關(guān)[7-9]，這些研究結(jié)果都提示P2X7R高表達可能會促進腫瘤的遷移和侵襲，造成患者的預后不良。在本研究中P2X7R高表達的乳腺癌患者OS時間較低表達患者短，但差異無統(tǒng)計學意義，分析其原因可能與選擇的對象有關(guān)，研究對象中未納入TNM分期Ⅳ期乳腺癌患者，以至于患者術(shù)后5年生存期相對較長，死亡率相對較低。此外，乳腺癌患者大多定期復查并及時有效治療，與其他腫瘤相比，乳腺癌的5年生存期也較長。研究P2X7R對乳腺癌患者OS的影響可能需要繼續(xù)隨訪，進一步觀察P2X7R是否影響患者的遠期生存率。

本研究證實了，P2X7R在乳腺浸潤性導管癌和導管原位癌中均高表達，其中P2X7R在導管原位癌中高表達，提示其具有促癌作用。由于乳腺癌的預后較差，容易復發(fā)轉(zhuǎn)移，而臨床上淋巴結(jié)可能出現(xiàn)跳躍轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，加上淋巴轉(zhuǎn)移灶微小，可能導致一些有高轉(zhuǎn)移風險的或隱匿的微小乳腺癌未被發(fā)現(xiàn)，而出現(xiàn)對乳腺癌的預后評估造成誤判的情況。而本研究通過分析乳腺癌患者術(shù)后DFS時間，發(fā)現(xiàn)P2X7R高表達的患者發(fā)生不良預后的風險是低表達患者的2.742倍，提示P2X7R也可作為輔助判斷乳腺癌預后風險的指標，可能對預測乳腺癌的預后具有重要的指導意義。

綜上所述，P2X7R在乳腺癌中高表達，其表達水平與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期、ER和PR表達水平存在相關(guān)性。P2X7R可預測乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的風險，可能是乳腺癌不良預后的潛在生物標志物。