胡倩倩李炳佘曼李濤周曉東

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院,上海 201508)

近視是目前發(fā)病率最高的屈光不正,但其發(fā)生機(jī)制仍不清楚[1-2]。DA 作為一種眼內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì),是實(shí)驗(yàn)性近視發(fā)展過(guò)程中的一種重要調(diào)節(jié)因子[3]。多巴胺通過(guò)其兩個(gè)受體家族發(fā)揮作用,即D1 類受體(D1DR)和D2 類受體(D2DR)。其中D1DR 主要分布在雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,D1DR 中主要以D1 受體為主;而D2DR 分布在光感受器細(xì)胞、色素上皮細(xì)胞以及產(chǎn)生多巴胺的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞[4]。以往的研究中對(duì)近視發(fā)生過(guò)程中D2DR 的相關(guān)研究較多,而對(duì)D1DR 的功能尚不清楚。關(guān)于D1DR 是否參與實(shí)驗(yàn)性近視的形成過(guò)程及其作用,目前的觀點(diǎn)并不統(tǒng)一[5-6]。有文獻(xiàn)報(bào)道,D1DR 拮抗劑SCH 23390 可抑制正常視覺(jué)對(duì)實(shí)驗(yàn)性近視的緩解作用[7],但也有研究稱SCH23390 不參與近視的過(guò)程[8]。近些年來(lái)有人提出D1 與D2 之間的平衡在近視的發(fā)生中更為重要[9],還有人發(fā)現(xiàn)SCH 23390 既可促進(jìn)白化豚鼠的近視進(jìn)展[6],也可促進(jìn)C57BL/6 小鼠和花色豚鼠形覺(jué)剝奪性近視(FDM)的形成[10-11]。這些結(jié)果提示,D1DR 在屈光發(fā)育及FDM 的發(fā)生中可能產(chǎn)生重要作用。

由于先前關(guān)于DA 及其受體的研究主要集中在FDM 和LIM 兩種近視模型中,且這兩種近視模型所模擬的近視機(jī)制也不相同[12]。當(dāng)前頻閃光作為“光污染”的重要組成部分[13],密切影響著人類的視覺(jué)質(zhì)量,頻閃光誘導(dǎo)的近視也逐漸成為一種新的誘導(dǎo)因素引起的屈光異常。針對(duì)此種誘導(dǎo)因素,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立豚鼠FLM 模型,檢測(cè)視網(wǎng)膜D1DR 表達(dá)的變化,同時(shí)給予D1DR 拮抗劑進(jìn)行干預(yù),探討D1DR在FLM 發(fā)生過(guò)程中的作用,并初步探索FLM 的潛在治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36 只2周齡普通級(jí)英國(guó)種短毛雄性三色豚鼠,體重90 ～110 g,購(gòu)自上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)【SCXK(滬)2017-0008】,飼養(yǎng)在上海市公共衛(wèi)生臨床中心【SYXK(滬)2015-0008】。在溫度24 ～26℃,相對(duì)濕度55% ～65%,光照周期12 h ∶12 h,光照強(qiáng)度0 ～600 lx 的環(huán)境中飼養(yǎng)。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道主義關(guān)懷,并獲得相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢驗(yàn)許可(公衛(wèi)倫審【2020】2020-A029-01)。

1.1.2 主要試劑與儀器

異氟烷(瑞沃德,中國(guó));戊巴比妥鈉(Sigma,USA);多巴胺D1 受體拮抗劑SCH 23390(Sigma,USA);兔抗鼠D1 受體多克隆受體(貨號(hào):ab81296,Abcam,USA);即用型免疫組化試劑盒(批號(hào):1311209902,福建邁新,中國(guó));Anti-GAPDH 抗體(Abcam,UK);山羊抗兔二抗(康為世紀(jì),中國(guó))。

帶狀光檢影鏡(KJ6B,六六視覺(jué),蘇州);SUPER SW1000 眼科A 超測(cè)量?jī)x(天津索維,中國(guó));Western Blot 用電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-rad,USA);ECL-Plus 成像系統(tǒng)(Merck Millipore,Germany);Acclaim C18 色譜柱(Thermo Fisher Scientific,USA);高效液相質(zhì)樸分析儀(ChemStation,Agilent 公司,USA)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理

36 只豚鼠隨機(jī)分為四組(n=9):(1)對(duì)照組(control group),不予特殊處理,開放飼養(yǎng);(2)頻閃光組(FLM group),參照邸悅等[13]的方法建立FLM模型;(3)頻閃光+溶劑組(FLM + Vehicle group),頻閃光環(huán)境中飼養(yǎng),飼養(yǎng)過(guò)程中對(duì)豚鼠右眼進(jìn)行玻璃體腔注射生理鹽水(20 μL);(4)頻閃光+D1DR 拮抗劑組(FLM + SCH 23390 group),頻閃光環(huán)境中飼養(yǎng),飼養(yǎng)過(guò)程中對(duì)豚鼠右眼進(jìn)行玻璃體腔注射D1DR 拮抗劑SCH 23390(0.5 μmol/L),每次注射20 μL,注射藥物劑量和濃度參照既往文獻(xiàn)[8]。玻璃體腔注射方法[14]:用異氟烷麻醉豚鼠,使用25 μL微量注射器,于豚鼠右眼上方角膜緣后1 mm 處進(jìn)針注入,進(jìn)針深度約為3 ～5 mm。4 d 重復(fù)1 次注射,從造模第14 天到第42 天,共注射8 次。各組豚鼠均飼養(yǎng)6周。

1.2.2 眼球生物測(cè)量

在造模第1 天和第42 天分別測(cè)量各組豚鼠右眼屈光度和眼軸長(zhǎng)度,測(cè)量均采用單盲法。以第42天測(cè)量值減去第1 天測(cè)量值之差作為該眼生物參數(shù)變化值。

(1)屈光度的測(cè)量:測(cè)量前使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴眼,5 min 滴1 次,共4 次,待瞳孔擴(kuò)大后進(jìn)行帶狀光檢影驗(yàn)光[15],等效球鏡記為球鏡+ 1/2 柱鏡,重復(fù)測(cè)量3 次后取平均值作為該眼屈光度值[15]。

(2)眼軸長(zhǎng)度的測(cè)量:測(cè)量前用鹽酸奧布卡因滴眼液進(jìn)行角膜表面麻醉,再應(yīng)用SUPER SW1000眼科A 超測(cè)量?jī)x進(jìn)行測(cè)量,A 超頻率為11 Hz。測(cè)量時(shí)探頭對(duì)準(zhǔn)角膜中心并垂直于角膜平面。待圖像穩(wěn)定清晰時(shí)記錄眼軸長(zhǎng)度,每只眼重復(fù)測(cè)量5 次后取平均值,精確到0.01 mm。

1.2.3 取材

6周造模結(jié)束后,所有豚鼠均采用過(guò)量注射戊巴比妥鈉進(jìn)行安樂(lè)死,迅速摘取右眼球,一部分進(jìn)行固定并制成石蠟切片,用于免疫組化檢測(cè),另一部分在冰塊上快速分離視網(wǎng)膜,隨后保存于-80℃冰箱中用于免疫印跡和HPLC-ECD 檢測(cè)。

1.2.4 免疫組化染色

將石蠟切片依次經(jīng)脫蠟,復(fù)水,滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,抗原修復(fù),封閉,一抗(D1DR,1 ∶1000)于4℃冰箱孵育過(guò)夜,二抗(1 ∶200 山羊抗兔)37℃孵育1 h,DAB 染色,蘇木素染核,脫水及透明后封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察及拍照。

1.2.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

將存放于-80℃的用于免疫印跡的視網(wǎng)膜組織取出,依次進(jìn)行稱重,總蛋白提取,濃度測(cè)定,制膠,電泳,轉(zhuǎn)膜,免疫反應(yīng),蛋白質(zhì)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)后,于成像系統(tǒng)曝光,并用Quantity One 軟件分析灰度值。

1.2.6 高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法

將待測(cè)的視網(wǎng)膜組織稱重,按1:10 體積勻漿,12000 r/min 離心,取上清液每份20 μL,注入38℃Acclaim C18 色譜柱(2.2 μm,2.1 mm × 100 mm)中,用磷酸緩沖液流動(dòng)相以0.2 mL/min 流速分離,檢測(cè)室電壓為+ 0.7 V,安全室電壓設(shè)為+ 0.75 V。所有數(shù)據(jù)均由Chem Station 進(jìn)行采集和分析。通過(guò)與提前設(shè)定的已知標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較得出峰值及相對(duì)濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,并進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析(ANOVA),采用Levene 檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),若方差齊則采用Bonferroni 法進(jìn)行組間兩兩比較,若方差不齊則采用Dunnett’s T3 法進(jìn)行組間兩兩比較;兩組間數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼生物參數(shù)變化

2.1.1 造模前后四組豚鼠右眼屈光度和眼軸長(zhǎng)度

造模前,四組豚鼠右眼屈光度、眼軸長(zhǎng)度均無(wú)顯著差異(P=0.220);造模6周后,與對(duì)照組相比,頻閃光組和頻閃光+溶劑組屈光度顯著降低(P＜0.001,P＜0.001),眼軸長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)(P=0.02,P＜0.001);而頻閃光+ D1DR 拮抗劑組的屈光度和眼軸長(zhǎng)度均無(wú)顯著差異(P=0.182,P=0.12)。與頻閃光組相比,頻閃光+溶劑組屈光度和眼軸長(zhǎng)度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.0,P= 0.95);頻閃光+D1DR 拮抗劑組屈光度值顯著升高(P=0.003),眼軸長(zhǎng)度無(wú)顯著差異(P=1.0)(見(jiàn)表1)。

表1 造模前后各組豚鼠右眼生物參數(shù)Table 1 Biological parameter values of the right eyes in the guinea pigs before and after the treatment

2.1.2 造模6周后各組豚鼠右眼屈光度和眼軸長(zhǎng)度變化值的比較

6周造模結(jié)束后,四組豚鼠屈光度和眼軸長(zhǎng)度的變化值為:對(duì)照組(-1. 70 ± 2. 38)D,(0. 24± 0. 05)mm;頻閃光組(-9. 36 ± 2. 10)D,(0. 50± 0. 17)mm;頻閃光+溶劑組(-8. 40 ± 2. 72)D,(0. 52 ± 0. 15) mm;頻 閃 光+D1DR 拮 抗 劑 組(-3. 88 ± 1. 52)D,(0. 26 ± 0. 15)mm。與對(duì)照組相比,頻閃光組、頻閃光+溶劑組屈光度變化值和眼軸長(zhǎng)度變化值均有顯著差異(P＜0. 001,P=0. 011;P＜0. 001,P= 0. 002),頻閃光+ D1DR拮抗劑組的屈光度變化值和眼軸長(zhǎng)度變化值均無(wú)顯著差異(P= 0. 271,P= 0. 999)(圖1)。與頻閃光組相比,頻閃光+溶劑組屈光度變化值和眼軸長(zhǎng)度變化值均無(wú)顯著差異(P= 1. 0,P=1. 0);而頻閃光+ D1DR 拮抗劑組屈光度變化值和眼軸長(zhǎng)度變化值有顯著差異(P＜0. 001,P=0. 042)(圖1)。

圖1 造模6周后各組豚鼠右眼生物參數(shù)變化值Note. A. Changes of refraction values of the right eyes in the four groups. B. Changes of axial length values of the right eyes in the four groups. Compared with the Control group, ?P＜0.05, ??P＜0.001. Compared with the FLM group, #P＜0.05, ##P＜0.001. (The same in the following figures)Figure 1 Changes of biological parameter values of the right eyes in the guinea pigs after 6 week treatment

圖2 頻閃光處理6周后,豚鼠視網(wǎng)膜D1DR 相對(duì)表達(dá)變化Note. A. Retinal sections were immunostained to analyze the effects of flickering light on the expression of retinal D1DR in the guinea pigs. B. The expression of D1DR was quantitatively analyzed by Western Blot.Figure 2 Changes of D1DR relative expression in the retina of guinea pigs after 6 week treatment

2.2 頻閃光處理6周后豚鼠視網(wǎng)膜中D1DR 的相對(duì)表達(dá)變化

6周造模結(jié)束后,通過(guò)免疫組化法檢測(cè)D1DR在對(duì)照組和頻閃光組豚鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:頻閃光組視網(wǎng)膜內(nèi)核層(INL)和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)D1DR(棕黃色)表達(dá)較對(duì)照組明顯增多。運(yùn)用免疫印跡法測(cè)得兩組豚鼠視網(wǎng)膜D1DR 的蛋白表達(dá)變化,與對(duì)照組相比,頻閃光組D1DR 相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P=0.001)(見(jiàn)圖2)。

2.3 造模后四組豚鼠右眼視網(wǎng)膜DA 含量及其代謝的變化

6周造模結(jié)束后,采用HPLC-ECD 測(cè)得四組豚鼠右眼視網(wǎng)膜DA、DOPAC 含量分別為:對(duì)照組(n=6),(81.54 ± 8.60)pg/mg,(66.87 ± 7.98)pg/mg;頻閃光組(n=6),(173.88 ± 32.06)pg/mg,(69.61± 18.36)pg/mg;頻閃光+溶劑組(n=6),(186.33 ±8.48) pg/mg,(73.80 ± 17.18) pg/mg;頻閃光+D1DR 拮抗劑組(n=6),(108.32 ± 14.95)pg/mg,(59.34 ± 5.63)pg/mg。與對(duì)照組相比,頻閃光組、頻閃光+溶劑組、頻閃光+D1DR 拮抗劑組DA 含量顯著升高(P=0.003,P＜0.001,P=0.027)(見(jiàn)圖3A),且DOPAC/DA 比值顯著降低(均P＜0.001)(見(jiàn)圖3C);與頻閃光組相比,頻閃光+溶劑組DA 含量及DOPAC/DA 比值無(wú)顯著差異(P=0.91,P=1.0)(見(jiàn)圖3A、3C),而頻閃光+D1DR 拮抗劑組DA含量顯著降低(P=0.013)且DOPAC/DA 比值明顯升高(P=0.02)(見(jiàn)圖3A、3C)。各組間DOPAC 含量差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見(jiàn)圖3B)。

圖3 造模6周后各組豚鼠右眼視網(wǎng)膜DA、DOPAC 含量及其比值Note. A. Levels of DA in the retina of guinea pigs. B. Levels of DOPAC levels in the retina of guinea pigs. C. DOPAC/DA ratio in the retina of guinea pigs.Figure 3 Retinal DA, DOPAC levels and DOPAC/DA ratio in the right eyes of guinea pigs after 6 week treatment

3 討論

我們的研究觀察到:豚鼠FLM 的過(guò)程中視網(wǎng)膜D1DR 表達(dá)上調(diào)、DA 含量升高以及DOPAC/DA 比值降低,選擇性D1DR 拮抗劑SCH 23390 能降低視網(wǎng)膜DA 含量并增加DOPAC/DA 比值,從而抑制豚鼠FLM 的進(jìn)展,抑制眼軸長(zhǎng)度的變化。

既往的一些研究認(rèn)為D1DR 參與了多種實(shí)驗(yàn)性近視的形成,使用D1DR 激動(dòng)劑或拮抗劑能夠促進(jìn)或者抑制實(shí)驗(yàn)性近視的進(jìn)展。比如:Jiang 等[6]在白化豚鼠自發(fā)性近視的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)SKF38393 在100 ng時(shí)能抑制近視的發(fā)展,SCH 23390 在2500 ng時(shí)能促進(jìn)近視的發(fā)展。Darbin 等[16]發(fā)現(xiàn)SKF38393能抑制小雞FDM,SCH23390 可促進(jìn)小雞FDM。這些研究表明,拮抗D1DR 對(duì)實(shí)驗(yàn)性近視的進(jìn)展可能具有促進(jìn)作用。然而,本研究發(fā)現(xiàn)拮抗D1DR 可能對(duì)近視的進(jìn)展具有抑制作用,這與上述研究不同。此外,也有報(bào)導(dǎo)支持我們的研究。如:劉銀[17]也發(fā)現(xiàn)全身敲除D1DR 會(huì)影響小鼠正常屈光發(fā)育而發(fā)生遠(yuǎn)視偏移。熊薇薇[18]的研究結(jié)果顯示,SKF38393以及SCH23390 均可以抑制小鼠FDM 的進(jìn)展。這些研究表明D1DR 在實(shí)驗(yàn)性近視的形成中具有重要意義,但其在不同近視模型中發(fā)揮的作用可能不一致,原因可能與不同類型近視的不同誘導(dǎo)因素有關(guān)。此外,動(dòng)物種屬及藥物劑量的不同也可能是產(chǎn)生差異的原因。本研究發(fā)現(xiàn)豚鼠FLM 中視網(wǎng)膜D1DR 的表達(dá)增多,這與我們前期研究的發(fā)現(xiàn)一致[19]。通過(guò)玻璃體腔注射D1DR 拮抗劑能夠抑制FLM 的進(jìn)展,使近視程度明顯減輕,眼軸延長(zhǎng)顯著減少。這說(shuō)明D1DR 參與了豚鼠FLM 的形成。

然而,D1DR 參與近視形成的機(jī)制仍不清楚。既往的研究認(rèn)為DA 作為視網(wǎng)膜中的一種重要神經(jīng)遞質(zhì),是眼球增長(zhǎng)的STOP 信號(hào)[20]。有研究用HPLC-ECD 測(cè)量形覺(jué)剝奪的小雞視網(wǎng)膜中DA 和其代謝產(chǎn)物的含量,發(fā)現(xiàn)DA 及DOPAC 含量都明顯低于正常組[21],而當(dāng)雞形覺(jué)剝奪恢復(fù)后,視網(wǎng)膜的DA和DOPAC 含量又恢復(fù)。這說(shuō)明在FDM 模型中,可能是由于DA 含量缺乏導(dǎo)致近視,而通過(guò)玻璃體內(nèi)注射DA 則可以抑制FDM 的發(fā)展[3]。然而,與FDM相反,Luo 等[19]發(fā)現(xiàn)豚鼠FLM 過(guò)程中伴隨著視網(wǎng)膜DA 含量的升高,推測(cè)FLM 的發(fā)生可能與DA 的過(guò)度增加有關(guān)。研究表明,頻閃光刺激能夠引起DA的釋放。比如Kramer[22]發(fā)現(xiàn),給予貓以恒定的光刺激DA 的釋放被抑制,而給予頻閃光卻刺激其DA的釋放。Puppala 等[23]把斑馬魚的視網(wǎng)膜從黑暗環(huán)境移至頻閃光環(huán)境中,發(fā)現(xiàn)DA 釋放增多。Kirsch等[24]也發(fā)現(xiàn)頻閃光能刺激魚視網(wǎng)膜中DA 的產(chǎn)生。與我們之前的研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)頻閃光刺激導(dǎo)致豚鼠視網(wǎng)膜DA 含量的增多及DA 轉(zhuǎn)化率的降低,推測(cè)FLM 的發(fā)生機(jī)制可能是過(guò)多頻繁的強(qiáng)光刺激引起視網(wǎng)膜的感光異常,從而導(dǎo)致大量DA 不斷合成,但分解代謝減少,進(jìn)而導(dǎo)致過(guò)多的DA 累積,而過(guò)多的DA 可能會(huì)給視網(wǎng)膜帶來(lái)不良影響甚至損害進(jìn)而引起屈光不正。

在本研究中,玻璃體腔給予D1DR 拮抗劑后,FLM 豚鼠眼球的近視樣改變受到抑制,且視網(wǎng)膜DA 含量下降,DOPAC/DA 比值升高。我們推測(cè)由于頻閃光刺激使得豚鼠眼內(nèi)DA 增多及D1DR 表達(dá)增強(qiáng),過(guò)多的DA 與D1DR 結(jié)合后激活下游分子通路,導(dǎo)致豚鼠發(fā)生近視。所以當(dāng)使用D1DR 拮抗劑SCH 23390 時(shí),DA 及其D1DR 受到抑制,進(jìn)而使得下游信號(hào)通路被抑制,最終使近視樣改變得到抑制。有研究表明,SCH 23390 可使斑馬魚腦中DA及DOPAC 水平明顯下降[25],這提示:SCH 23390 處理后,可能伴有DA 及DOPAC 水平的變化。因此,多巴胺D1 受體可能通過(guò)影響DA 及其代謝水平而參與豚鼠FLM 的發(fā)生發(fā)展。

本研究提示D1DR 參與了豚鼠FLM 的形成。拮抗D1DR 能夠抑制豚鼠FLM 的進(jìn)展。此外,D1DR 激動(dòng)劑對(duì)FLM 的進(jìn)展會(huì)有何作用,這是我們今后關(guān)注的一個(gè)內(nèi)容,我們將進(jìn)一步探討D1DR 在FLM 中的作用及其機(jī)制,從而為近視的防治提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。