朱華劉小海李卓郭亞茜杜曉鵬蘇磊李永寧?秦川?

(1. 衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021; 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院,北京 100730)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變,起病隱匿,呈進(jìn)行性發(fā)展。主要臨床表現(xiàn)為記憶認(rèn)知障礙、精神人格行為異常。神經(jīng)原纖維纏結(jié)、老年斑沉積、神經(jīng)元的廣泛缺失是這種疾病的特征性病理改變[1-2]。目前AD 是世界上最常見的一種老年癡呆癥,在中國患者數(shù)已超過600 萬,60 歲人群中AD 的患病率為3%～5%。在世界范圍AD 患者達(dá)3.5 億,到2030年將超過6 億,85 歲以上人群發(fā)病率可能超過50%。最近的研究表明,腸道微生物組與AD 之間存在密切關(guān)聯(lián)[3-4],大量數(shù)據(jù)顯示正常腸道菌群對機體腦功能的維持具有重要作用,而腸道菌群失調(diào)可能與AD 的危險因素如年齡、應(yīng)激、肥胖和糖尿病等密切相關(guān),并可能參與多種AD 伴發(fā)精神癥狀如焦慮、抑郁等的發(fā)病。

動物模型是研究腸道菌群與AD 關(guān)系的重要工具。無菌動物(germ free animal,GF)是通過無菌剖宮產(chǎn)或無菌胚胎移植術(shù)獲得,在無菌狀態(tài)下繁育,采用現(xiàn)有檢測手段檢測不到活的微生物、寄生蟲的動物[5]。利用GF 小鼠移植人糞便構(gòu)建的人源菌群動物(human-flora animal,HFA),通過在GF 小鼠體內(nèi)模擬人的腸道微環(huán)境,為研究人腸道微生態(tài)系統(tǒng)提供了一個更為直接、有效的模型,其優(yōu)勢在于能有效控制宿主的遺傳背景、菌群、飲食及其它環(huán)境因素[6-7]。本研究選用無菌小鼠為實驗對象,通過糞菌移植方法將AD 患者腸道菌群移植到無菌小鼠體內(nèi),運用生物信息學(xué)、代謝組學(xué)方法結(jié)合動物的臨床癥狀、組織病理學(xué)分析等手段對模型進(jìn)行評價,為探索腸道菌群在AD 發(fā)生發(fā)展中的病理生理機制提供研究基礎(chǔ),為早期發(fā)現(xiàn)、治療AD 提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

無菌級C57BL/6J 小鼠28 只,體重17 ～22 g均為雌性,課題組自己繁育并飼養(yǎng)于無菌隔離設(shè)施中。動物實驗期間隔離器內(nèi)溫度22 ～25℃,濕度40% ～70%。動物在隔離器內(nèi)自由攝食飲水。實驗所用無菌小鼠飼料經(jīng)50 kGy60Co γ 射線輻照滅菌,飼育用飲水、墊料、籠具、灌胃針等經(jīng)126℃,30 min 的高溫高壓滅菌處理。隔離設(shè)施合格證號【SYXK-(京)2018-0019】。實驗獲本研究所實驗動物使用與管理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:ZH17003)。

1.1.2 主要試劑與儀器

徠卡ASP300S 全自動組織脫水機、徠卡1150H+C 石蠟包埋機、櫻花IVS410 石蠟切片機、Bio-Rad IQ5PCR 儀。Bio-Plex MAGPIX System 懸液微珠芯片平臺?？贵w芯片檢測試劑盒Bio-Plex Pro Mouse Cytokine(貨號M60013RDPD)。老年斑染色6E10抗體,Biolegend(貨號IG-39320)。

1.2 方法

1.2.1 糞便供體信息

移植當(dāng)日各有3 位阿爾茨海默癥患者、3 位健康志愿者符合糞便供體標(biāo)準(zhǔn)(見表1)?；颊呒敖】抵驹刚邩悠返牟杉勋@得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),倫理審核號:S-K478。阿爾茨海默癥患者及健康志愿者均來自中國北方,為典型非素食中國飲食。符合2011 版國際阿爾茨海默癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];排除非典型或繼發(fā)性AD;無其它神經(jīng)精神癥狀;消化道無器質(zhì)性病變,未進(jìn)行過手術(shù);無酒精依賴、吸煙、糖尿病等代謝性疾病;糞便采集前4～8周內(nèi)未服用益生菌、抗生素、非甾體類藥物。

表1 實驗志愿者信息Table 1 General information of the volunteers

1.2.2 建立糞菌移植模型

28 只6 ～8周齡無菌C57BL/6J 小鼠,雌性,分為健康對照組(CON)和阿爾茨海默癥(AD)組,每組14只。收集志愿者清晨排出的新鮮糞便,無菌、厭氧條件下分別將健康人和AD 患者的糞便混勻。各稱取1 g用100 mL 0.1 mol/L PBS(pH=7.2)溶解,振蕩混勻后用無菌紗布過濾糞便殘渣后制成糞便菌懸液。每只無菌小鼠經(jīng)口灌胃接種0.4 mL 糞便懸液。

1.2.3 檢測指標(biāo)

接種糞便懸液后每天觀察動物生長情況,每周測量體重。移植6周安樂7 只動物,移植10周安樂剩余,解剖時檢測指標(biāo):

(1)16S rDNA 擴增子測序

動物在解剖前采集糞便。糞便收集在隔離器內(nèi)完成,裝入無菌凍存管傳出,存入-80℃冰箱。動物實驗結(jié)束后統(tǒng)一按參考文獻(xiàn)[9]的方法提取基因組DNA、構(gòu)建文庫、上機測序并對結(jié)果進(jìn)行分析。

(2)腦內(nèi)及血中Aβ 含量測定

動物安樂死后,取血,血液用10000 r/min 離心10 min,取上清。冰盤上剝離腦組織分成兩半,右半腦嗅球及小腦,用預(yù)冷的生理鹽水沖洗,吸干水分后制成10%腦組織勻漿。酶聯(lián)免疫吸附法測定血清及腦勻漿中Aβ40 和Aβ42 含量。

(4)細(xì)胞因子

使用抗體芯片技術(shù)檢測血清種IL-1β、IL-10、IL-6、TNF-α、IL-33、TGF-β 等與腦部炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子。

(5)組織病理學(xué)

小鼠左側(cè)大腦固定于中性福爾馬林溶液,24 h內(nèi)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋處理,制作橫斷面切片,厚度5 μm。切片隔3 取1,貼到經(jīng)多聚賴氨酸處理過的玻片上,按照文獻(xiàn)[10]的方法對小鼠海馬和皮層內(nèi)進(jìn)行老年斑免疫組化染色,觀察是否有老年斑生成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)形式表示,分析使用SPSS 22.0 軟件包,組間比較使用t檢驗,率的比較采用卡方檢驗。P＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癥狀和體征

從動物實驗開始到被安樂時止,所有小鼠攝食飲水正常、毛色順滑、精神良好。對照組動物體重增平穩(wěn),模型組小鼠從第5周開始體重增長加放緩,與CON 組比較,除第8周外差異無顯著性(圖1)。

圖1 動物體重變化Figure 1 Changes of body weights in the CON and AD groups

2.2 16S rDNA 擴增子測序

2.2.1 菌群多樣性檢測結(jié)果

OTUs 數(shù)可直觀反映樣本中物種豐富度和均勻度。各組檢測出的OTUs 在97%(種)水平上進(jìn)行劃分后將代表序列與數(shù)據(jù)庫注釋文件進(jìn)行對比,結(jié)果顯示AD 組在糞菌移植后6周、10周2 個時間點獲得的OTUs 數(shù)均減少,與CON 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。α 多樣性反映的是單個樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性,Shannon 指數(shù)大、Simpson 指數(shù)小表示腸道菌群多樣性強,ACE 和Chao1 指數(shù)大表示菌群豐度高。AD 組糞菌移植后6周、10周的Shannon 指數(shù) 均 降低(P＜0.05,P＜0.01),Simpson 指數(shù)均升高(P＜0.05,P＜0.01);ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)在糞菌移植后6周、10周的數(shù)值均降低(P＜0.05),與CON 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

表2 模型組與對照組腸道菌群α-多樣性指數(shù)分析結(jié)果(±s)Table 2 Comparison of the α-diversity indexes of gut microbiota between the CON and AD groups(±s)

表2 模型組與對照組腸道菌群α-多樣性指數(shù)分析結(jié)果(±s)Table 2 Comparison of the α-diversity indexes of gut microbiota between the CON and AD groups(±s)

注:與對照組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。Note. Compared with the control group, ?P＜0.05,??P＜0.01.

組別Groups OUTs Chao1 Shannon Simpson ACE造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage造模6周6 weeks after gavage造模10周10 weeks after gavage對照組Control group 343.00 ±97.50309.30 ±72.70484.19 ±32.15416.52 ±71.044.10 ±0.784.02 ±0.650.86 ±0.170.90 ±0.13497.62 ±82.29440.60 ±95.24模型組AD group 878.20 ±105.10551.80 ±142.221024.18 ±106.39685.61 ±99.415.48 ±0.454.37 ±0.710.91 ±0.120.77 ±0.111015.02 ±116.42695.87 ±109.17 P 0.0001?? 0.1192 0.0002? 0.0944 0.0484? 0.8912 0.7814 0.0747 0.0003?? 0.1141

2.2.2 腸道菌群在科和屬水平上的構(gòu)成

在科水平,造模2 個時間點AD 組擬桿菌科豐度升高(P＜0.01,P＜0.05,圖2A),與CON 比較差異有顯著性。毛螺菌科(P＜0.001,圖2B)、消化鏈球菌科(P＜0.01,圖2C)豐度降低,與CON 比較差異有顯著性。

在屬水平,造模2 個時間點AD 組擬桿菌屬豐度升高(P＜0.01,P＜0.05,圖3A),與CON 比較差異有顯著性。梭菌屬(P＜0.01,P＜0.05,圖3B)、毛螺菌屬(P＜0.01,P＜0.0001,圖3C)、寄生菌屬(P＜0.01,P＜0.001,圖3D)豐度降低,與CON 比較差異有顯著性。

2.2.3 UPGMA 聚類樹和主坐標(biāo)分析

UPGMA 聚類樹是根據(jù)加權(quán)Unifrac 或非加權(quán)Unifrac 距離將距離最小的樣本聚在一起,形成一個新的聚點,通過不斷將聚點進(jìn)行聚集,獲得聚類樹。比較2 組的UPGMA 聚類結(jié)果:AD 組、CON 組在移植后6周、10周時的加權(quán)Unifrac 距離分別為0.732、0.751,表明AD 組與CON 組在菌群豐富度多樣性方面存在明顯分離,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05,圖4A)?；诩訖?quán)Unifrac 距離的主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示,糞菌移植后CON 組、AD 組腸道菌群分布在不同區(qū)域,組間分離明顯。而同組不同時間點的菌群群落則分布在相同區(qū)域甚至互相重疊,聚合較好。(圖4B)。

2.3 血液及腦中Aβ 含量

AD 組小鼠在建模10周時血液和腦中Aβ40 含量升高(P＜0.05,P＜0.01,圖5A,5C),與CON 組比較差異有顯著性。血液和腦中的Aβ42 含量在兩個時間點均未見差異有顯著性(圖5B,5D)。

圖2 腸道菌群在科水平上的構(gòu)成Note. Compared with the control group, ?P＜0.05,??P＜0.01,???P＜0.001. (The same in the following figures)Figure 2 Relative abundance of the bacteria in gut microbiota at family level in the CON and AD groups

2.4 細(xì)胞因子檢測

檢測結(jié)果顯示,與老年斑形成相關(guān)的細(xì)胞因子中,IL-1β 在建模6周時濃度降低(P＜0.05,圖6A);IL-10 在建模6周時濃度升高(P＜0.01,圖6B);TGF-β 在建模10周時濃度降低(P＜0.01,圖6C),與CON 組比較差異有顯著性。IL-6、IL-33、TNF-α 在建模6周和10周時差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6D、6E、6F)。

2.5 組織病理學(xué)結(jié)果

在造模的2 個時間點,CON 組(圖7A,7C)和AD 組(圖7B,7D)小鼠腦內(nèi)均未觀察到有老年斑生成。

3 討論

已有多篇文獻(xiàn)報道人類腸道菌群可在無菌大、小鼠體內(nèi)定植,其腸道菌群構(gòu)成保持了人腸道菌群的特征,在腸道細(xì)菌數(shù)量、代謝速率和酶活性等方面與人體內(nèi)菌群相似[11-13]。大小鼠體積小,相對經(jīng)濟,更適于進(jìn)行日益增長的腸道微生態(tài)與疾病相關(guān)研究的需求。國內(nèi)外大量報道的嚙齒類人源化動物模型以小鼠為主,應(yīng)用于腸道菌群與疾病關(guān)系、腸道菌群對免疫系統(tǒng)影響、益生菌益生元的安全性有效性評價等研究中[14-16]。但針對阿爾茨海默癥建立的人源化動物模型國內(nèi)還未見報道。

根據(jù)Hazenberg 等[17]、Che 等[18]的研究結(jié)果和本課題組前期建立冠心病HFA 小鼠的經(jīng)驗[9],本研究選擇經(jīng)口途徑接種志愿者糞便菌懸液建立小鼠模型,在建模6周、10周時收集小鼠的新鮮糞便、血液、腦組織樣本檢測菌群結(jié)構(gòu)豐度、細(xì)胞因子、老年斑生成等指標(biāo)。α-多樣性分析結(jié)果顯示,AD 組的Shannon 指數(shù)在糞菌移植后6周、10周兩個時間點均降低(P＜0.05,P＜0.01),而Simpson 指數(shù)均升高(P＜0.05,P＜0.01)。Shannon 指數(shù)大、Simpson 指數(shù)小表示腸道菌群的多樣性強,結(jié)果提示AD 模型組小鼠腸道菌群多樣性降低。在科和屬的水平,擬桿菌科和擬桿菌屬的菌群豐度顯著升高,與文獻(xiàn)報道[19]的人的結(jié)果一致。β-多樣性分析結(jié)果顯示CON 組和AD 組小鼠的Weighted Unifrac 距離組間明顯分離,差異有顯著性(P＜0.05)。CON 組、AD組小鼠組內(nèi)建模后不同時間點菌群群落分布在同一象限,聚合較好。而2 組間菌群分布在不同區(qū)域,表明志愿者腸道菌群在無菌小鼠體內(nèi)定植,且模型組、對照組小鼠腸道的微生物區(qū)系存在明顯差異。

圖3 腸道菌群在屬水平上的構(gòu)成Figure 3 Relative abundance of the bacteria in gut microbiota at genus level in the CON and AD groups

圖4 β-多樣性分析結(jié)果Figure 4 β-diversity analysis of the CON and AD groups

圖5 血清和腦內(nèi)Aβ 含量檢測結(jié)果Figure 5 Detection of the Aβ level in serum lipid and brain in the CON and AD groups

圖6 細(xì)胞因子檢測結(jié)果Figure 6 The serum levels of cytokines in the CON and AD groups

圖7 腦內(nèi)老年斑檢測Figure 7 Histopathological changes in the brain of the CON and the AD groups

據(jù)文獻(xiàn)報道,AD 患者腸道微生物變化與慢性神經(jīng)炎癥相關(guān)。由促炎分子引發(fā)的神經(jīng)炎癥引起血腦屏障的通透性增加,炎癥反應(yīng)加重,最終導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞增生及神經(jīng)元丟失[20-22]。擬桿菌屬是革蘭氏陰性菌,脂多糖是其外膜的主要成分,可引發(fā)全身性炎癥并促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的釋放。脂多糖還與與AD 病理學(xué)相關(guān),當(dāng)與Aβ 肽共孵育時脂多糖可增強淀粉樣蛋白原纖維形成。在動物中全身注射脂多糖可增強小膠質(zhì)細(xì)胞活性,促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平增加,引起淀粉樣蛋白沉積和tau 相關(guān)病理學(xué)改變[23]。但AD 是一種復(fù)雜的慢性退行性疾病,衰老、遺傳、外周病變和環(huán)境因素都可能成為其誘發(fā)因素。本研究通過經(jīng)口糞菌移植方式建立了阿爾茨海默癥HFA 小鼠模型,模型小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)與豐度出現(xiàn)了與患者類似的改變,擬桿菌屬豐度顯著增加,可用于菌群與AD 關(guān)系、相關(guān)微生態(tài)制劑評價等。但相關(guān)炎癥因子、血液及腦內(nèi)Aβ 含量等并未出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的改變,需要結(jié)合遺傳、衰老等因素做進(jìn)一步研究。