徐松濤李嘉穎沈利葉郁晨徐雁云潘永明孫志超陳民利?

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所,國家中醫(yī)藥管理局實驗動物三級實驗室,杭州 310053;2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,醫(yī)學(xué)影像科,杭州 310006)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)主要由脂肪、血栓、結(jié)締組織和碳酸鈣在血管中的沉積引起的,包括冠狀動脈、腦動脈、主動脈及腎動脈等其他血管的動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化仍是世界范圍內(nèi)心血管疾病的首要原因[1],據(jù)世界衛(wèi)生組織報道全世界每年約有1500 萬人死于動脈粥樣硬化引起的心血管疾病[2]。另外,動脈粥樣硬化也是引起腦血管疾病的主要原因之一,可導(dǎo)致動脈壁增厚、硬化和管腔狹窄,使得動脈供血的組織或器官最終會引發(fā)缺血或壞死,導(dǎo)致腦卒中、短暫性腦缺血等腦血管疾病的發(fā)生,嚴(yán)重威脅人類的健康和生命。因此,探索有效的動脈粥樣硬化診斷評估方法具有重要意義[3]。

目前臨床上診斷頸動脈粥樣硬化的影像學(xué)方法眾多,包括超聲成像(US)、磁共振影像學(xué)(MRI)、血管造影、正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(PET)/計算機斷層掃描(CT)等[1],其中超聲以無創(chuàng)、便攜、操作簡單快速等優(yōu)點廣泛用于臨床血管疾病的診斷[4]。MRI具有較高的空間分辨率,不僅可以評價血管的狹窄程度,還可以動態(tài)觀察血管壁的變化[5]。盡管關(guān)于動脈粥樣硬化的診斷已有較多的檢測方法,但大多局限于單一的診斷,而對幾種檢測方法的比較和評價研究較少。因此,仍需大量基礎(chǔ)研究推進(jìn)動脈粥樣硬化的研究進(jìn)展。自1908年首次使用高膽固醇飲食兔研究主動脈壁斑塊形成以來,動物模型一直是研究動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程和機制的重要工具[6]。兔是較為理想的AS 模型動物,與大小鼠比,兔的脂代謝過程與人類相似,更能模擬人類AS病程;與大型動物比,兔易于處理且研究成本較低[7]。高膽固醇飲食聯(lián)合球囊損傷法是目前復(fù)制AS 常用的造模方法之一[8],球囊損傷后血管內(nèi)皮功能障礙、炎癥反應(yīng)嚴(yán)重,持續(xù)的高膽固醇飲食又加劇了脂質(zhì)積聚在血管內(nèi)膜上,加速AS 病變的進(jìn)程,8周即可形成AS 病變[9]。因此,本研究采用超聲和高分辨率磁共振成像(HRMRI)技術(shù)觀察高膽固醇飲食聯(lián)合球囊損傷兔頸動脈動脈粥樣硬化模型的病變狀況,為臨床前AS 模型診斷評估以及對于延緩AS 的進(jìn)展和改善其預(yù)后的診斷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

18 只普通級雄性4 ～5 月齡日本大耳白兔,體重為2.2 ～2.5 kg,來源于新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場【SCXK(浙)2015-0004】;飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心普通級兔實驗室【SYXK(浙)2018-0012】,環(huán)境溫度(22 ± 2)℃,相對濕度:50%～60%,光照:12 h/12 h 明暗交替;單籠飼養(yǎng),自由飲食。所有飼養(yǎng)和操作均經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心動物倫理委員會批準(zhǔn)(IACUC 批準(zhǔn)號:20191021-08)。

1.1.2 主要試劑與儀器

TC、TG 試劑盒(上海圣能德賽診斷技術(shù)有限公司,中國)。2.5 mm PTCA 球囊導(dǎo)管(Terumo 公司,日本),全自動生化分析儀(7020,日立公司,日立),組織脫水機(STP120,Microm 公司,德國),半自動病理切片機(RM2245,Leica 公司,美國),Nano Zoomer 數(shù)字切片掃描設(shè)備(2.0 RS,濱松公司,日本)數(shù)字化彩色超聲診斷儀(G50,飛依諾科技有限公司,中國),3.0 T MRI 掃描儀(GE Discovery MR 750,GE 公司,美國),8 通道兔專用線圈(上海晨光醫(yī)療技術(shù)公司,中國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模

取日本大耳白兔18 只,適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后,按體重隨機分為2 組,即正常對照組(n=9)和模型組(n=9)。正常對照組飼喂常規(guī)飼料(每天120 g),模型組飼喂1%高膽固醇飼料(每天120 g)2周后,行經(jīng)皮頸動脈腔內(nèi)球囊成形術(shù),簡言之,術(shù)前禁食不禁水12 h 后,用3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉,并給予肝素鈉(500 IU/kg)以防止術(shù)中急性血栓形成,仰臥位保定,頸部皮膚剃毛消毒后,縱向切口約4 cm,暴露并游離右側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)行球囊損傷術(shù),分別用動脈夾臨時夾閉CCA 近心端及頸內(nèi)動脈(internal carotid artery, ICA) 起始段, 頸外動脈(external carotid artery,ECA)遠(yuǎn)心端結(jié)扎、近心端用線輕輕提起,距ECA 起始段0.5 cm 處用一次性無菌注射器針頭穿刺小口,球囊導(dǎo)管從此處輕輕插入CCA 中。球囊內(nèi)充以生理鹽水至6 atm,牽拉旋轉(zhuǎn)導(dǎo)管,回抽球囊內(nèi)液體至0 atm 后回抽導(dǎo)管,重復(fù)3 次,取出球囊導(dǎo)管,結(jié)扎ECA,恢復(fù)血流,縫合切口,術(shù)后繼續(xù)飼喂1%高膽固醇飼料6周,以建立頸動脈粥樣硬化模型。術(shù)后連續(xù)3 d 施以青霉素鈉80 萬單位預(yù)防感染。整個實驗周期為8周。

1.2.2 體重與血脂檢測

在造模4周和8周時動物禁食12h 后,空腹稱重,并取耳中動脈肝素抗凝血5 mL,分離血漿,在全自動生化儀上測定血漿總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)。

1.2.3 頸動脈超聲檢查

造模4周、8周時行頸動脈超聲檢查。用3% ～5%異氟烷吸入誘導(dǎo)并面罩維持兔的麻醉狀態(tài),頸部皮膚備皮后,在超聲探頭上涂抹偶聯(lián)劑,通過超聲診斷儀依頸動脈走行方向探測頸總動脈的長軸切面,顯示頸總動脈的管腔內(nèi)徑、內(nèi)中膜厚度(IMT)、狹窄程度等,用彩色多普勒圖像顯示頸總動脈內(nèi)血流情況,用脈沖多普勒測量血流速度,利用回聲強度不同和彩色多普勒來觀察是否存在斑塊及其大小與性狀。診斷標(biāo)準(zhǔn)有四項:(1)IMT,測量最初的高回聲與血液的交接面到第二個高回聲層之間的距離,采用五個隨機位置的IMT 平均值;(2)血流速度,采用三個收縮期最高血流速度的平均值;(3)血管阻力指數(shù)(resistance index,RI):RI=(收縮期流速-舒張期流速)/收縮期流速,采用三次阻力指數(shù)的平均值;(4)狹窄率:狹窄率=(血管最大內(nèi)徑-狹窄部血管徑)/血管最大內(nèi)徑,采用3 個長軸切面狹窄率的平均值。

1.2.4 MRI 掃描

造模8周時,實驗兔禁食不禁水12 h,經(jīng)耳緣靜脈注射30 mg/kg 戊巴比妥鈉溶液1 mL/kg 后麻醉,行MRI 掃描,參數(shù)包括快速飛行時間三維成像(3DTOF):重復(fù)時間20 ms;回波時間3.69 ms;回波鏈長度1;視野225 mm;切片厚度0.6 mm;T2 加權(quán)渦輪自旋回波成像:重復(fù)時間4120 ms;回波時間62 ms;回波鏈長度14,視野140 mm;切片厚度2 mm;T1 加權(quán)取樣的完美性,應(yīng)用優(yōu)化對比度,使用不同的角度演變,脂肪飽和成像:重復(fù)時間900 ms;回波時間15 ms;回波鏈長度52;視野160 mm;切片厚度0.63 mm。將原始圖像傳入工作站處理進(jìn)行最大信號強度投影(maximum intensity projection,MIP)成像。觀察頸部血管情況,用Image J 軟件測量狹窄率。

1.2.5 組織病理學(xué)觀察

行安死術(shù)后解剖右側(cè)頸總動脈血管進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。取一部分冰凍切片后,油紅“O”染色,觀察脂質(zhì)沉積程度,用Image J 軟件定量分析脂質(zhì)含量。另取一部分用中性甲醛固定后,脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色,用NDP. view 2 軟件觀察形態(tài)學(xué)變化并定量分析內(nèi)中膜厚度(IMT)、血管管腔面積(lumen area,LA)、內(nèi)彈力層圍繞面積(internal elastic lamina area,IELA) 和外彈力層圍繞面積(external elastic lamina area,EELA),并計算狹窄率,即(IELA-LA)/(EELA-LA)×100。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組兔體重及血脂水平的變化

與對照組相比,造模4周后模型組血漿總膽固醇水平明顯升高(P＜0.01),但體重和甘油三酯水平均無顯著性差異(P＞0.05);造模8周后,模型組兔體重、總膽固醇和甘油三酯水平均顯著升高(P＜0.05,P＜0.01)(圖1)。

2.2 頸動脈二維灰階超聲結(jié)果

頸總動脈灰階超聲圖像顯示,對照組在造模4周和8周時血管內(nèi)膜光整,未見斑塊形成;模型組造模4周時血管內(nèi)膜毛糙、內(nèi)中膜增厚、回聲增強、可見斑塊形成;8周時內(nèi)中膜明顯增厚、強回聲區(qū)明顯、管腔變窄。定量分析結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組的IMT 和狹窄率隨病程的進(jìn)展而顯著升高(P＜0.01)(圖2)。

2.3 頸動脈多普勒超聲結(jié)果

頸總動脈狹窄遠(yuǎn)段的彩色多普勒和頻譜多普勒超聲結(jié)果顯示,對照組在造模4、8周時管腔內(nèi)血流充盈良好、呈層流特點、血流波形呈高尖狀;模型組造模4周時可見散在的血流信號、血流波形仍呈低尖狀,8周時血流信號紊亂、頻帶增寬、峰型變鈍、頻譜圖形邊界部分模糊(圖3A)。定量分析結(jié)果顯示,模型組造模4周和8周的PSV 顯著低于對照組(P＜0.01),而模型組RI 則顯著高于對照組(P＜0.05,P＜0.01);與模型組4周時比,模型組8周時RI 顯著增加(P＜0.05)(圖3B、3C)。

2.4 高分辨率磁共振成像檢測結(jié)果

HRMRI 檢查顯示正常對照組頸總動脈未見狹窄,模型組右側(cè)頸總動脈有明顯狹窄形成;水平層面上,正常對照組雙側(cè)頸總動脈管腔光滑、未見斑塊形成,模型組右側(cè)頸總動脈明顯狹窄、有斑塊形成。定量分析結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組頸總動脈狹窄率顯著增加(P＜0.01)(見圖4)。

2.5 AS 病變分析結(jié)果

兔頸總動脈HE 染色顯示,正常對照組平滑肌細(xì)胞排列整齊、形態(tài)良好,內(nèi)膜無增厚,管腔正常,未見狹窄;模型組內(nèi)膜明顯增厚、管腔狹窄,大量泡沫細(xì)胞形成脂質(zhì)斑塊,血管平滑肌細(xì)胞遷移、增殖(圖5A)。定量分析顯示,模型組IMT 和狹窄率均顯著高于對照組(P＜0.05,P＜0.01)(圖5B、5C)。油紅“O”染色顯示,模型組頸動脈中有大量脂質(zhì)沉積;定量分析顯示,與對照組比,模型組脂質(zhì)含量顯著升高(P＜0.01)(圖5D)。

2.6 B 超、HRMRI 檢測結(jié)果與病理結(jié)果的相關(guān)性分析

超聲檢測與HE 染色定量分析所得的中內(nèi)膜厚度和狹窄率均具有顯著性相關(guān)(P＜0.01),相關(guān)系數(shù)分別為0.77 和0.99;同樣,HRMRI 檢測和HE 染色定量分析所得的狹窄率具有顯著性相關(guān)(r=0.99,P＜0.01);超聲檢測和HRMRI 檢測所得的狹窄率亦具有相關(guān)性(r=0.98,P＜0.01)。

圖2 二維灰階超聲成像與定量分析Note. A. Two-dimensional gray-scale ultrasound representative images of the rabbit right CCA at 4 and 8 weeks, the red arrow indicates IMT and the yellow“+” shows plaques. B, C. Quantitative analysis of IMT and stenosis rate of rabbit right CCA. Compared with the 4th week model group, ##P＜0.01.Figure 2 Two-dimensional gray-scale ultrasound imaging and quantitative analysis

圖3 多普勒超聲成像與定量分析Note. A. Representative doppler ultrasound images of the rabbit right CCA at 4 and 8 weeks, the yellow and white arrow indicates PSV and EDV,respectively. B, C. Quantitative analysis of PSV and RI of rabbit right CCA. Compared with the 4th week model group, #P＜0.05.Figure 3 Doppler ultrasound imaging and quantitative analysis

圖4 高分辨率磁共振成像與定量分析Note. A. Representative HRMRI images of the rabbit right CCA at 8 weeks,the yellow and white arrows indicate stenosis and plaques,respectively. B.Quantitative analysis of stenosis rate in rabbit CCA by HRMRI.Figure 4 High resolution magnetic resonance imaging and quantitative analysis

圖5 兔頸總動脈病理染色結(jié)果與定量分析Note. A. Representative image of HE staining and Oil Red “O” staining of the rabbit CCA. B, C. Quantitative analysis of IMT and stenosis rate in rabbit CCA by HE staining. D. Quantitative analysis of lipid content by oil red “O” staining.Figure 5 Pathological staining results and quantitative analysis of rabbit CCA

3 討論

臨床上頸動脈粥樣硬化是全身性動脈粥樣硬化的反映,研究表明通過頸動脈超聲測量的內(nèi)中膜厚度和頸動脈斑塊能預(yù)測人類認(rèn)知障礙和CAD 風(fēng)險[10]。兔AS 模型被廣泛用于AS 臨床前研究,與僅使用高膽固醇飲食的自發(fā)性病變比,通過球囊損傷術(shù)破壞內(nèi)皮并使血管壁擴張,能夠快速形成斑塊[11]。本研究在高膽固醇飲食背景下行球囊損傷術(shù)8周后,模型兔體重明顯增加,并具有高脂血癥。從病理檢測結(jié)果中可見,8周時模型組頸動脈出現(xiàn)新生內(nèi)膜,新生內(nèi)膜是血管損傷后修復(fù)的普遍反應(yīng)[12],表現(xiàn)為明顯的內(nèi)膜增厚、大量泡沫細(xì)胞浸潤形成脂質(zhì)核、中膜平滑肌細(xì)胞遷移到內(nèi)膜并大量增殖、纖維帽形成。

二維灰階超聲成像圖能明顯觀察到模型兔的強回聲斑塊,且8周時的IMT 和狹窄率均比4周時增加明顯,這與AS 病變進(jìn)程相符。與病理結(jié)果的相關(guān)性分析表明,IMT 和狹窄率均有相關(guān)性,但模型組IMT 值普遍大于病理定量分析結(jié)果,這可能與兔頸動脈內(nèi)徑相對較小,超聲測量時較難分辨內(nèi)、中、外膜三者的明確界限,存在一定誤差,且測量時管腔血液充盈,與病理檢測時狀態(tài)不一致有關(guān)。有研究顯示,隨著狹窄程度的增加,PSV 呈上升趨勢[13],但本實驗頻譜多普勒超聲結(jié)果顯示,PSV 隨AS 的發(fā)展呈下降趨勢,這可能與AS 后期血管狹窄程度高有關(guān),狹窄后段血流量不足導(dǎo)致PSV 降低。盡管在狹窄部位測量PSV 是多普勒評估狹窄程度的理論基礎(chǔ),但由于球囊損傷術(shù)形成的AS 病變比人類自發(fā)性病變程度深,實際操作過程中很難檢測到狹窄部位的血流情況。然而狹窄后段也能得到有價值的信息,在狹窄后端,通過狹窄段的高速血流突然散開到相對低流速低壓的區(qū)域而產(chǎn)生紊亂的血流信號,反應(yīng)在頻譜上就是“頻帶增寬”[14]。研究顯示隨著AS 的病程進(jìn)展,血管管腔變窄,其阻力指數(shù)升高[15],這與本實驗結(jié)果保持一致。

最近研究表明,與超聲比,HRMRI 就動脈粥樣硬化斑塊的診斷更有效[16-17]。HRMRI 的MIP 重建圖像可以突破血管形態(tài)上的限制,直觀輸出圖像,以更準(zhǔn)確地評估病變程度。HRMRI 的優(yōu)勢還在于可以獲得和結(jié)合多對比圖像來區(qū)分血管壁內(nèi)的組織成分,如3D-TOF MRA 是目前最常用的“亮血”技術(shù),能夠識別斑塊成分及出血情況,有利于鑒別易損斑塊[18]。本實驗采用HRMRI 技術(shù)進(jìn)行兔頸動脈AS 檢測,MIP 成像結(jié)果顯示模型組右側(cè)頸總動脈有明顯狹窄,3D-TOF 成像結(jié)果顯示AS 斑塊形成。此外,相關(guān)性分析也表明HRMRI 定量分析所得的狹窄率與病理結(jié)果顯著相關(guān)。近來也有一些研究將HRMRI 技術(shù)應(yīng)用到其他實驗動物中,如大鼠[19]、狗[20]等,運用不同類型的線圈均可獲得清晰成像,達(dá)到診斷評估效果。但HRMRI 仍存在一定局限性,圖像采集時間較長且需要特定線圈,檢測成本較高。

綜上所述,超聲和HRMRI 技術(shù)均能無創(chuàng)檢測兔頸動脈粥樣硬化模型的病變,均可診斷AS 斑塊是否形成,而HRMRI 能更清晰、直觀地判斷血管狹窄及斑塊的嚴(yán)重程度,適合用于藥物治療效果的評價。