王燕柳榮朱向東

(甘肅中醫(yī)藥大學,蘭州 730000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種以大腸黏膜與黏膜下炎癥為主要特征的慢性非特異性炎癥性疾病,據(jù)統(tǒng)計UC 患者罹患結(jié)腸癌風險極高,對患者造成的危害及痛苦極大[1-2]。目前認為UC 的發(fā)病是外源物質(zhì)引起宿主反應(yīng)、基因和免疫影響三者相互作用的結(jié)果,其病程漫長,常反復發(fā)作。盧茂永[3]認為UC 緩解期以本虛為主,本病虛多表現(xiàn)為脾陽虛,也有兼腎陽不足的情況。任彥等[4]認為年老者、病程長者及病情嚴重或反復者,證素以脾、腎、濕、氣虛為主,故脾腎陽虛是UC 常見的證型之一。四神丸為治療脾腎陽虛之腎泄證(五更瀉)經(jīng)典方劑。明·王肯堂《證治準繩·類方》卷六在《證治準繩·類方》卷六有“治脾胃虛弱,大便不實,飲食不思,或泄瀉腹痛等證。肉豆蔻二兩、補骨脂四兩、五味子二兩、吳茱萸浸,炒一兩上為末,生姜八兩,紅棗一百枚,煮熟取棗肉和末丸,如桐子大。每服五七十丸,空心或食前白湯送下”。研究發(fā)現(xiàn)四神丸及其方中單味藥具有止瀉、抑制腸蠕動、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎鎮(zhèn)痛等作用[5-11]。四神丸治療脾腎陽虛型UC 的具體分子機制尚不完全清楚,本實驗通過研究四神丸對脾腎陽虛型UC 大鼠結(jié)腸組織病理改變,結(jié)腸組織中PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白免疫組化表達水平的影響來探討四神丸治療脾腎陽虛型UC 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

120只70d 齡SPF 級Wistar 大鼠,雌雄各半,體重(180 ± 20)g,甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心【SCXK(甘)2015-0002】。大鼠飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級屏障實驗室【SYXK(甘)2015-0005】。飼養(yǎng)環(huán)境:實驗室溫度21 ～25℃,相對濕度50% ～60%,光照12 h/12 h 明暗交替,噪音＜50 dB。所有本研究中使用的實驗方案由甘肅中醫(yī)藥大學動物管理委員會及動物福利倫理委員會批準,嚴格按照3R 原則進行動物飼養(yǎng)及實驗(項目批準號:2018-081)。

1.1.2 藥物

四神丸組方藥物,購于蘭州惠仁堂大藥房,甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定中心鑒定合格,實驗處方:補骨脂、吳茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜、大棗,制備方法:按照4 ∶1 ∶2 ∶2 ∶4 ∶4的比例稱取補骨脂、吳茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜、大棗,將生姜、大棗先煎,去姜去棗核,將棗肉搗成泥,其余藥物打粉,混入棗泥并搓成梧桐子大的水丸。使用時將四神丸水丸高、中、低劑量組分別按生藥3.2、1.6、0.8 g/kg 劑量打粉,加適量熱蒸餾水攪拌均勻后備用。番瀉葉藥劑制備:番瀉葉,購于蘭州惠仁堂大藥房,甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定中心鑒定合格,將番瀉葉按照大鼠體重10 g/kg 取定量的藥材,加適量水煎煮,過濾藥液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將藥液濃縮,濃度為1 g/mL,裝入消毒過的藥瓶,放入冰箱保存?zhèn)溆?。美沙拉嗪藥劑制?購于葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司(批號170804),將美沙拉嗪腸溶片按大鼠體重0.36 g/kg 劑量打粉,加適量蒸餾水攪拌均勻后備用。氫化可的松注射液:購于國藥集團容生制藥有限公司(批號1708201)。2,4-二硝基苯磺酸:購于梯希愛(上海) 化成工業(yè)發(fā)展有限公司(批號FHB01-NRAJ)。

1.1.3 主要試劑與儀器

兔SP 試劑盒(中杉金橋公司,SP-9001),HE染色試劑盒(索萊寶,G1120),蘇木素(索萊寶,1140),p-AKT Ser473(CellSignaling,4060S),mTOR(CellSignaling, 2983S), PI3K p85 (ImmunoWay,YT3711),p-mTOR Ser2448(ImmunoWay,YP0176),p-PI3K p85(abcam,GR194710-78),β-actin(abcam,GR3255609-1),AKT(GeneTex,43264)。

H1650R 型臺式高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司,中國),2016 型切片機(LEICA,德國),KD-T 電腦生物組織攤烤片機(科迪儀器設(shè)備有限公司,中國),KD-BM 生物組織包埋機(科迪儀器設(shè)備有限公司,中國),BI2000 免疫組化分析系統(tǒng)(泰盟軟件有限公司,中國),iMark 酶標儀(Bio-Rad,美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模

參照文獻方法采用病證結(jié)合法使用DNBS/乙醇溶液灌腸+ 皮下注射氫化可的松+ 番瀉葉灌胃建立脾腎陽虛型UC 大鼠模型[12]。對SPF 級Wistar大鼠進行番瀉葉灌胃10 mL/(kg·d),配合氫化可的松皮下注射10 mg/(kg·d),每日1 次,連續(xù)21 d。21 d 后,禁食24 h,腹腔麻醉,使用注射器配16 號灌胃針經(jīng)肛門插入到達結(jié)腸部位,注射時將肛門捏緊,將DNBS/乙醇溶液(每只25 mg DNBS + 50%的乙醇0.25 mL)緩慢注入大鼠腸腔內(nèi),完全注入藥液后再注入1 mL 空氣,捏取大鼠尾巴使大鼠保持倒立狀態(tài)1 min,使藥液與結(jié)腸充分接觸,結(jié)束后拔出灌胃針,待麻醉清醒后繼續(xù)正常喂養(yǎng)。

1.2.2 大鼠的分組與給藥

將120 只Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,隨機抓出20 只作為空白組,其余100 只進行造模。造模成功后,將剩余成功建立模型的大鼠隨機分為模型組、陽性對照(美沙拉嗪)組、四神丸高劑量組、四神丸中劑量組、四神丸低劑量組?？瞻捉M和模型組灌服蒸餾水,美沙拉嗪組按生藥0.36 g/kg 劑量灌胃,四神丸高、中、低劑量組分別按生藥3.2、1.6、0.8 g/kg劑量灌胃,灌胃量均為10 mL/kg。各組灌胃每日1 次,連續(xù)21 d。

1.2.3 標本采集

大鼠給藥治療21 d 結(jié)束后,各組大鼠禁食不禁水1 d,注射麻醉,頸椎脫臼法處死大鼠。用組織剪剪下大鼠結(jié)腸組織,縱剪剖開,截取大鼠結(jié)腸病變最嚴重處組織,剪去組織周邊多余脂肪,用預冷過的生理鹽水反復沖洗干凈,放濾紙上吸干液體,將結(jié)腸組織置于裝有4%多聚甲醛溶液的玻璃瓶中固定保存,用于蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosin Staining,HE)染色以及鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(Streptavidin-perosidase,SP)實驗。

1.2.4 各組大鼠結(jié)腸組織病理學改變

將固定在4%多聚甲醛溶液中的結(jié)腸組織取出,用PBS 緩沖液進行沖洗,乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟包埋后制成石蠟切片后,依次進行脫蠟→水化→蘇木素染色→伊紅染色→脫水封片→顯微鏡進行下拍照觀察。

1.2.5 SP 免疫組化法檢測結(jié)腸組織中PI3K p85、p-PI3K p85、 Akt、 p-AKT Ser473、 mTOR、 p-mTOR Ser2448 蛋白表達水平

將固定于4%多聚甲醛溶液中的結(jié)腸組織取出進行石蠟包埋后制成石蠟切片后,依次進行脫臘→水化→抗原修復→正常血清封閉→滴加PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 抗體→DAB 顯色→復染→返藍→梯度酒精脫水→透明封片→通過圖像分析系統(tǒng)觀察分析PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 的蛋白表達位置及平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗所得的計量資料采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計處理。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以平均值± 標準差(±s) 表 示, 采 用 單 因 素 方 差(One-way,ANOVA)分析,方差齊時組間比較用最小顯著法(least significant difference,LSD)檢驗,方差不齊選用Tamhane’s T2 檢驗;若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布,則用中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示,用W-H 秩和檢驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠結(jié)腸組織病理學改變

空白組:染色均勻,細胞核清晰可見,腸黏膜層結(jié)構(gòu)完整(紅色箭頭),基層腺體(黑色箭頭)分布均勻。模型組:與空白組相比較,染色清晰均勻,細胞結(jié)構(gòu)清晰可見,腸黏膜部分消失(紅色箭頭),腺體消失(黑色箭頭),有大量的炎性細胞浸潤(藍色箭頭),聚集于黏膜層和基層。治療組:與模型組相比較,藥物組炎性細胞減少(藍色箭頭),黏膜層結(jié)構(gòu)不同程度的恢復正常(紅色箭頭),美沙拉嗪組和四神丸中劑量組效果最好,黏膜結(jié)構(gòu)接近空白對照組。四神丸低劑量組與模型組相比,炎性細胞稍有減少(藍色箭頭),可見少量的腺體結(jié)構(gòu)(黑色箭頭),黏膜層雖被炎性細胞侵潤,損傷嚴重但腺體結(jié)構(gòu)可見(見圖1)。

圖1 各組大鼠結(jié)腸病理形態(tài)Figure 1 Pathological morphology of colon in each group

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織中PI3K p85、p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448蛋白平均光密度值柱狀圖(±s,n =8)Note. Compared with the model group, △P＜0.05, △△P＜0.01. Compared with the mesalazine group, ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01.Figure 2 Histogram of average optical density values of PI3K p85, p-PI3K p85, Akt, p-AKT Ser473, mTOR,p-mTOR Ser2448 protein in colon tissue of rats in each group(±s,n=8)

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織中PI3K p85、p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白的定位表達水平

與空白組相比,模型組PI3K p85、p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白平均光密度值顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比,PI3K p85、p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、pmTOR Ser2448 蛋白平均光密度值在四神丸高、中、低劑量組及美沙拉嗪組均有不同程度下降,有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.05)。與美沙拉嗪組比較,四神丸高劑量組Akt 蛋白平均光密度值顯著高于美沙拉嗪組(P＜0.01),p-PI3K p85、p-AKT Ser473、pmTOR Ser2448 蛋白平均光密度值高于美沙拉嗪組(P＜0.05),PI3K p85、mTOR 蛋白平均光密度值高于美沙拉嗪組,但無顯著性差異(P＞0.05);四神丸低劑量組p-PI3K p85、Akt、p-AKT Ser473、mTOR、pmTOR Ser2448 蛋白平均光密度值顯著高于美沙拉嗪組(P＜0.01),PI3K p85 蛋白平均光密度值高于美沙拉嗪組(P＜0.05);四神丸中劑量組PI3K p85、p-PI3K p85、 Akt、 p-AKT Ser473、 mTOR、 p-mTOR Ser2448 蛋白平均光密度值高于美沙拉嗪組,但無顯著性差異(P＞0.05)(見圖2、3)。

圖3 各組大鼠結(jié)腸蛋白免疫組化結(jié)果Figure 3 Immunohistochemical results of protein in colon of rats in each group

3 討論

近年來,UC 在我國發(fā)病率明顯增高,其中病程長且病變范圍廣泛者癌變危險性極高,對患者造成極大的危害[1-2]。UC 病位在大腸,但病機關(guān)鍵是脾虛,病程較長或反復發(fā)作的UC 發(fā)展過程常見脾腎兩虛。從中西醫(yī)結(jié)合角度來看,陽氣虛證病人機體免疫力也相應(yīng)低下,致使吞噬系統(tǒng)紊亂,而很多補益藥都已證實有增強免疫力,加速吞噬細菌、毒素機能,控制炎癥的作用[12]。西藥治療UC 價格昂貴,副作用大,且無法根治反復發(fā)作。中醫(yī)復方從中醫(yī)整體觀念上對UC 進行整體調(diào)節(jié)具有副作用少、治療后不易反復發(fā)作等優(yōu)勢。臨床上,四神丸治療脾腎陽虛型UC 療效確切,可修復腸道黏膜損傷,治療腸道病變,緩解或治愈UC 相關(guān)癥狀[13-15]。四神丸相關(guān)的實驗研究也進一步證實,四神丸可修復腸黏膜屏障,抑制炎癥反應(yīng),改善胃腸道功能[16]。

PI3K/Akt/mT0R 信號通路在代謝、炎癥、腫瘤等疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。研究[17-22]發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mT0R 信號通路影響細胞增殖、分化和凋亡,在腸道炎癥及腫瘤反應(yīng)中起著重要作用,認為PI3K/Akt/mT0R 信號通路可能同時參與了UC 的炎癥及癌變過程。通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路亦能夠誘導巨噬細胞自噬從而抑制炎癥反應(yīng)[23]?，F(xiàn)代藥理學表明[10,11,16,24-26],四神丸可抑制炎癥通路過度激活,能一定程度的阻止癌變,恢復機體免疫平衡,修復腸黏膜屏障,抑制腸道推進作用。其中單味藥均具有不同程度的止瀉、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用,可有效治療UC。本研究以PI3K/Akt/mTOR 信號通路對UC 的影響為切入點,進一步探討四神丸治療脾腎陽虛型UC 可能的分子機制。

本實驗結(jié)果顯示,模型組結(jié)腸組織腸黏膜部分消失,腺體消失,有大量的炎性細胞浸潤,聚集于黏膜層和基層;而黏膜損傷可能與PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白平均光密度值顯著升高有關(guān)。經(jīng)藥物預后與模型組比較,藥物組炎性細胞減少,黏膜層結(jié)構(gòu)不同程度的恢復正常;同時PI3K p85、p-PI3K p85、AKT、p-AKT Ser473、mTOR、p-mTOR Ser2448 蛋白平均光密度值在四神丸高、中、低劑量組及美沙拉嗪組均有不同程度下降。其中以美沙拉嗪組和四神丸中劑量組改變最為明顯,這說明四神丸可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活,進而調(diào)控炎癥因子,調(diào)節(jié)機體免疫、自噬,從而修復腸道黏膜損傷。