楚璐萌田子穎崔蕊吳嬌于海川

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院,河南省分子診斷與醫(yī)學檢驗技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 新鄉(xiāng) 453003;2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院,河南 新鄉(xiāng) 453003; 3. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院,河南省生物精神病學重點實驗室,河南 新鄉(xiāng) 453002; 4. 河南省鄭州市第七人民醫(yī)院,鄭州 450000)

斑馬魚(Danio rerio)是研究發(fā)育、造血和遺傳學的強大模型[1],其具有體外受精發(fā)育、產(chǎn)卵量大、胚胎透明等多種優(yōu)勢[2-4]。斑馬魚與人類之間的遺傳同源性達87%[5],同時具有遺傳操作和再生能力[6],這使得斑馬魚成為目前研究脊椎動物胚胎發(fā)育和造血分化的優(yōu)秀動物模型[7]。低氧是影響水生系統(tǒng)的最重要的壓力源之一[8-9],目前有關(guān)低氧對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響機制研究報道非常少。斑馬魚胚胎發(fā)育是一個復雜的、高度協(xié)同的過程。斑馬魚與人的造血分化是保守一致的,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并克隆了造血過程中的階段特異性表達基因,包括EPO、Globin 和GATA1 等[3,10]。研究發(fā)現(xiàn)紅細胞生成受到低氧環(huán)境的影響,其中一個或多個異?？赡軐е虏煌愋偷募t細胞生成障礙[10]。本文采用聯(lián)苯胺染色、鄰聯(lián)茴香胺染色及瑞氏吉姆薩染色來顯示紅細胞的生成及形態(tài)學變化,觀察了低氧下斑馬魚胚胎的整個發(fā)育過程,并對常氧和低氧下的基因表達水平進行了比較,從而加深了低氧對脊椎動物影響的認識。目前涉及低氧對斑馬魚影響的詳細研究很少,本研究為揭示低氧影響斑馬魚胚胎發(fā)育和紅細胞生成的具體過程提供了新數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本實驗得到新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物實驗倫理委員會的審批(XYLL-2020163),于河南省免疫與靶向藥物重點實驗室中進行實驗,實驗動物實驗使用許可證號【SYXK(豫)2018-0014】。約100 對狀態(tài)良好的生育期的AB 品系斑馬魚養(yǎng)殖于上海海圣斑馬魚實驗養(yǎng)殖系統(tǒng)中,光照/黑暗14 h/10 h,水溫為28℃。受精卵在28.5℃下孵育,并根據(jù)Kimmel 等[2]方法進行分期。

1.1.2 主要試劑與儀器

3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(MACKLIN,中國);瑞氏吉姆薩染液(Baso,中國);AO 染液(索萊寶,中國); 鄰 聯(lián) 茴 香 胺(Sigma, 美 國); TRIzol 試 劑(ambion,美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊,中國)。

斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(上海海圣生物實驗設備有限公司,中國);YCP 系列三氣培養(yǎng)箱(長沙華曦電子科技有限公司,中國);ZEISS Discovery.V8 體式熒光顯微鏡(ZEISS,德國);BX51 正置熒光顯微鏡(Olympus,日本);PikoRealTM實時熒光定量PCR 檢測儀(Thermo Fisher Scientific,美國);Tanon-3500 凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司,中國)。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚的繁殖和胚胎處理

斑馬魚是根據(jù)已有文獻的標準條件飼養(yǎng)和繁殖[11],交配和胚胎培養(yǎng)方法由中國斑馬魚資源中心提供。12 hpf(hours post fertilization)后收集高質(zhì)量的胚胎進行實驗。將胚胎分為低氧和常氧培養(yǎng)組,低氧組的胚胎暴露于5% O2濃度下。每12 h 收集1 次斑馬魚胚胎,鑒定胚胎的發(fā)育階段。在不同發(fā)育時期,從常氧和低氧組各隨機選取10 個胚胎,用ZEISS ZEN 軟件計算卵黃囊的比例;用Image J 軟件分析體表色素沉著的比例;在體視顯微鏡下觀察并計算胚胎個體的心率。

1.2.2 聯(lián)苯胺染色和鄰聯(lián)茴香胺染色

聯(lián)苯胺染色按照本實驗室的方法進行[12],鄰聯(lián)茴香胺染色參照文獻方法進行[13]。使用體式顯微鏡對各發(fā)育階段的胚胎進行觀察并拍照,用Image J軟件分析整個斑馬魚中染色部分的占比。圖像至少是從3 個獨立的實驗中獲得,每組至少有6 個胚胎或幼魚。

1.2.3 瑞氏吉姆薩染色

對胚胎進行斷尾處理收集血細胞,制備血涂片。斑馬魚預處理及瑞氏吉姆薩染色方法參照文獻進行,并稍作改進[14-15]。使用BX51 正置熒光顯微鏡觀察并鑒定紅細胞類型,并依據(jù)統(tǒng)計學方法計算紅細胞在所有血細胞中的比例。

1.2.4 AO 染色

隨機收集10 個胚胎/幼魚移至包含1 mL ddH2O 的EP 管中,然后加入30 μL 10 μg/mL 的AO 染液,避光染色1 h[16-17]。立即使用體式熒光顯微鏡觀察并拍攝胚胎中的熒光。

1.2.5 RNA 提取和Real time PCR

每組隨機取50 個胚胎/幼魚,溶于TRIzol 試劑中提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用特異性基因引物(見表1)進行常規(guī)RT-PCR 和Real time PCR。

表1 實時熒光定量PCR 引物名稱及序列Table 1 Primer names and sequences of Real time PCR

1.3 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 7 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以平均值± 標準差(±s)表示,采用t檢驗比較兩組樣本的均值,多組間的樣本采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 低氧延遲斑馬魚胚胎發(fā)育

依據(jù)前期實驗結(jié)果,最終選定5% O2濃度作為低氧條件。將12 hpf 的斑馬魚胚胎(圖1A)隨機分為兩組,分別在常氧和低氧下培養(yǎng)。24 hpf,咽囊期原基-5 期視網(wǎng)膜色素沉著和皮膚黑色素沉積較早,卵黃囊內(nèi)出現(xiàn)紅細胞,此時出現(xiàn)早期心臟搏動(圖1B);36 hpf,原基-25 期,絨毛膜中的斑馬魚胚胎出現(xiàn)早期運動、尾部色素沉著和血液循環(huán)(圖1C);48 hpf,長胸鰭期,卵黃囊開始變薄,側(cè)邊帶出現(xiàn)黑素細胞,視網(wǎng)膜上的虹膜色素細胞豐富,頭部出現(xiàn)黃色(圖1D);60 hpf,高胸鰭期,血液循環(huán)明顯,視網(wǎng)膜虹膜色素細胞環(huán)加深(圖1E);72 hpf,孵化期的突口階段,虹膜色素細胞覆蓋眼睛,背部與頭部相同顏色(圖1F);84 hpf,斑馬魚胚胎已經(jīng)發(fā)育到幼魚期(圖1G)。低氧下,胚胎在24 hpf 時發(fā)育到卵裂期的20-體節(jié)階段,在胚胎背側(cè)區(qū)域共觀察到20個體節(jié),相當于在常氧下19 hpf 時的發(fā)育階段(圖1H)。同樣,低氧下,36、48、60、72、84 hpf 的胚胎發(fā)育階段分別為原基-6 期、原基-25 期、高胸鰭期、長胸鰭期和胸鰭期,分別與常氧下的25、36、42、48、60 hpf 一致(圖1I、1J、1K、1L、1M),即低氧在一定程度上延遲了斑馬魚胚胎的整體發(fā)育。

2.2 低氧對于斑馬魚卵黃囊、色素沉著、胚胎孵化和心率的影響

在相同發(fā)育階段,低氧組斑馬魚的卵黃囊體積明顯大于常氧組(圖2A、2B);低氧組斑馬魚眼睛、頭部、軀干和卵黃囊中的色素沉著明顯低于常氧組(圖2A、2C);在相同的長胸鰭階段,常氧組胚胎完成了孵化,低氧組胚胎仍然包裹在絨毛膜中(圖2A)。常氧組斑馬魚在24 hpf 時胚胎開始出現(xiàn)早期的心臟搏動,而此時低氧組未發(fā)現(xiàn)心臟搏動。從24 hpf 開始,無論是否低氧培養(yǎng),胚胎早期心率隨時間變化趨勢一致,約60 hpf 后心率趨于穩(wěn)定,而在相同發(fā)育時間,低氧組斑馬魚胚胎心率明顯低于常氧組(圖2D)。另外,相同發(fā)育階段,低氧下的胚胎心率明顯低于常氧(圖2E)。

2.3 低氧減少斑馬魚早期胚胎發(fā)育紅細胞的生成

鄰聯(lián)茴香胺染色結(jié)果顯示,經(jīng)低氧處理的斑馬魚胚胎的鄰聯(lián)茴香胺的著色面積顯著降低,染色部位主要位于卵黃囊,而常氧組斑馬魚胚胎的染色部位則逐漸從卵黃囊轉(zhuǎn)移到心臟和頭部(圖3A-a, c,e, g)。聯(lián)苯胺染色結(jié)果與鄰聯(lián)茴香胺染色基本一致,常氧下胚胎的主要染色部位逐漸從卵黃囊和大血管轉(zhuǎn)移到心臟、大血管和節(jié)間血管,低氧下的染色部位逐漸從卵黃囊轉(zhuǎn)移到心臟和血管,節(jié)間血管染色不明顯(圖3B)。使用Image J 軟件對聯(lián)苯胺染色結(jié)果進行分析,在同一發(fā)育階段,低氧下胚胎的著色面積比例明顯低于常氧(圖3C)。AO 染色結(jié)果顯示,低氧下斑馬魚胚胎卵黃囊的前部和上部有大量的凋亡細胞(綠色熒光顆粒);但其會隨著斑馬魚胚胎的發(fā)育逐漸減少(圖3A-b, d, f, h)。

圖1 斑馬魚胚胎發(fā)育代表性圖片(× 150)Figure 1 Representative images of zebrafish embryonic development(× 150)

圖2 低氧對于斑馬魚胚胎卵黃囊、色素沉著和心率的影響Note. A. Representative images of zebrafish embryos(× 150). B,C. The proportion of yolk sac volume and the proportion of pigmentation. D.The heart rate of zebrafish embryos under normoxic and hypoxic conditions at different developmental time. E. The heart rate of zebrafish embryos under normoxic and hypoxic conditions at the same developmental stage. Compared with normal oxygen, ?P＜0.05, ??P＜0.01,???P＜0.001.(The same in the following figures)Figure 2 Effects of hypoxia on yolk sac, pigmentation and heart rate of zebrafish embryos

2.4 低氧抑制紅細胞成熟

瑞氏吉姆薩染色結(jié)果顯示,同一發(fā)育時期,低氧下斑馬魚的總紅細胞(包括幼稚紅細胞和成熟紅細胞)比例低于常氧(圖4A、4B)。圖4A 中,藍色箭頭處為未成熟紅細胞,胞體呈圓形,胞質(zhì)豐富,細胞核呈圓形或類圓形,藍色,多居中;紅色箭頭處為成熟的紅細胞,胞體比未成熟紅細胞小,呈橢圓形,胞質(zhì)豐富,細胞核呈橢圓形,深紫色。低氧下84 hpf 的斑馬魚血液中只有未成熟的紅細胞存在。但是同一發(fā)育階段下常氧和低氧相比較,紅細胞總數(shù)的比例沒有統(tǒng)計學意義(圖4C)。以往的研究表明,斑馬魚血液中的紅細胞呈連續(xù)性年齡分布,成熟的紅細胞血紅蛋白含量較高[18]。這些結(jié)果表明低氧在一定程度上抑制了紅細胞的成熟。

圖3 低氧對斑馬魚胚胎血紅蛋白的生成和細胞凋亡的影響Note. A. O-dianisidine staining pictures and Acridine orange staining pictures of zebrafish embryos(× 150). B. Representative benzidine staining of zebrafish embryos(× 100). C. Quantitative line chart of Benzidine staining.Figure 3 Effects of hypoxia on hemoglobin production and cell apoptosis of zebrafish embryos

圖4 低氧抑制紅細胞成熟Note. A. May-Grunwald Giemsa staining of zebrafish embryonic blood cells(× 1000). B. The proportion of red blood cells in blood of zebrafish embryos at different developmental time. C. At the same developmental stage, the proportion of red blood cells in blood of zebrafish embryos.Figure 4 Hypoxia inhibits red blood cell maturity

2.5 低氧對于斑馬魚胚胎發(fā)育過程中造血相關(guān)基因表達的影響

通過繪制斑馬魚胚胎發(fā)育早期的造血細胞分化發(fā)育圖譜,我們選定了部分重要的造血相關(guān)基因進行表達檢測。首先使用RT-PCR 的方法觀察了在正常培養(yǎng)過程中斑馬魚胚胎發(fā)育6、12、24、48、72 hpf時一些重要造血相關(guān)基因的表達情況(圖5A),在24 hpf 之后,紅系特異性造血因子GATA1 和Globin 隨著發(fā)育時間的增加其表達強度逐漸增加;同時其他的與造血相關(guān)的基因c-myc、scl、GATA2 和NFIL3 等在斑馬魚胚胎發(fā)育早期,也隨著發(fā)育時間呈逐漸升高的趨勢,而l-plastin 在早期的表達更加明顯。另外,Real time PCR 結(jié)果顯示了常氧和低氧下一些紅系相關(guān)基因的表達差異。Globin 在相同的發(fā)育時期低氧下的表達強度要明顯低于常氧下的表達強度,與之相反Epo 基因在低氧下則顯示較高,同時其他相關(guān)造血基因在某些發(fā)育階段也顯示出低氧下表達強度低于常氧下(圖5B)。這些基因表達的變化情況證實并解釋了先前觀察到的低氧抑制斑馬魚胚胎早期紅系分化的結(jié)果。

圖5 低氧對于斑馬魚胚胎發(fā)育中基因表達的影響Note. A. Some mRNA level was analyzed by RT-PCR during embryonic development of zebrafish. B. Real time PCR was employed to analyze the differential expression of hematopoietic related mRNA.Figure 5 Effects of hypoxia on gene expression in embryonic development of zebrafish

3 討論

為了探討低氧對斑馬魚胚胎發(fā)育和造血作用的影響,我們使用了不同的低氧濃度和低氧處理時間。前期的實驗結(jié)果表明當受精后的胚胎直接暴露于1% O2濃度下超過24 h,死亡率幾乎是100%。我們最終選定了5% O2濃度作為最適低氧濃度,而12 hpf 作為最佳低氧處置時間。斑馬魚胚胎是一個“封閉系統(tǒng)”,且發(fā)育早期不能合成血紅蛋白來供應自身氧氣的需求,只能通過外界氧氣的被動擴散才能滿足斑馬魚胚胎的正常生長發(fā)育,所以絨毛膜上的孔洞是氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)從外部水環(huán)境運輸?shù)脚咛ズ颓宄龔U物所必需的[19],通過獨特的絨毛膜結(jié)構(gòu),未孵化的胚胎感受到低氧并影響其發(fā)育,本研究發(fā)現(xiàn)低氧延緩了斑馬魚的孵化時間。卵黃囊的主要作用是為斑馬魚早期發(fā)育提供所需的營養(yǎng)物質(zhì),使發(fā)育不受外界干擾[20]。但有研究發(fā)現(xiàn)抵抗動物缺氧的最重要的防御機制之一是能量消耗的下調(diào)[21],本實驗結(jié)果顯示:低氧下斑馬魚胚胎卵黃囊的體積占比大于常氧,即實驗證實低氧抑制卵黃囊的消耗。同時低氧減少了胚胎的體外色素沉著,這可能是由于低氧降低細胞色素P450 的表達[22],或者因為低氧影響了酪氨酸酶的活性從而延遲了胚胎色素細胞的發(fā)育[23]。總之,低氧從整體上抑制了斑馬魚胚胎的發(fā)育過程,而持續(xù)的低氧不利于胚胎發(fā)育和生物學進化,在某些情況下甚至可能導致嚴重的疾病或死亡。魚類心臟對多種環(huán)境因素敏感,其中之一就是低氧。在低氧狀態(tài)下,由于外部氧氣濃度較低,通過絨毛膜被動擴散進入斑馬魚胚胎的氧氣含量無法滿足斑馬魚胚胎心臟形成和發(fā)揮功能的需求,從而導致其出現(xiàn)持續(xù)性心動過緩,通過降低心率和能量消耗從而提高成活率[24]。與文獻報道相一致,本研究發(fā)現(xiàn)低氧會導致斑馬魚心率發(fā)生復雜的變化,其確切的變化取決于發(fā)育階段,并且在較小的程度上取決于飼養(yǎng)溫度[25]。同時,以往文獻顯示,低氧導致斑馬魚胚胎出現(xiàn)一定程度的心包水腫,伴有卵黃囊水腫,胚胎血管系統(tǒng)發(fā)育不良,血液流速變緩[26-28]。我們的研究結(jié)果再一次證實了這一結(jié)果,心包水腫影響血液循環(huán)、心率,并很可能對血細胞生成有一定影響。

低氧不僅影響斑馬魚胚胎的形態(tài)和心臟功能,造血分化和紅細胞生成也受到了影響。斑馬魚是研究胚胎紅細胞生成的理想系統(tǒng)[29]。紅細胞的產(chǎn)生在許多水平上受到調(diào)節(jié),包括基因表達的控制,環(huán)境條件的改變。本研究結(jié)果顯示胚胎發(fā)育早期低氧對紅細胞產(chǎn)生和成熟具有抑制作用。這可能是由于在胚胎發(fā)育的早期,低氧下卵黃囊前部和上部的血供不足引起的細胞凋亡,但在發(fā)育后期斑馬魚胚胎出現(xiàn)低氧耐受,凋亡模式發(fā)生改變,細胞凋亡數(shù)量減少。為了揭示低氧對紅細胞生成過程中基因表達可能存在的調(diào)控機制,我們檢測了一些重要的造血相關(guān)基因。有研究表明斑馬魚胚胎發(fā)育后期,12 hpf 胚胎血紅蛋白的表達水平開始增加,并在孵化前后達到高峰,且胚胎血紅蛋白基因水平一直保持在高水平,直到成年[30]。本實驗的初步結(jié)果表明,常氧下12 hpf,紅系特異性造血因子Globin 開始表達,隨著發(fā)育時間的增加其表達強度逐漸增加,這與已有的研究報道結(jié)果是一致的;但是低氧下Globin 的表達水平降低,及HiF1α 的表達水平升高,提示在斑馬魚胚胎發(fā)育早期,低氧確實影響基因表達,但其分子機制尚不清楚。據(jù)報道,低氧可以通過調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎的HIF 通路,影響斑馬魚胚胎造血干細胞的產(chǎn)生和造血末期紅細胞的終末分化[31-33]。

綜上所述,低氧延緩了斑馬魚胚胎的發(fā)育,抑制了紅細胞的產(chǎn)生和成熟。我們的結(jié)果加深了人們對低氧誘導脊椎動物產(chǎn)生影響的認識,同時也提供了低氧對斑馬魚胚胎發(fā)育和紅細胞生成的最新認識。由于斑馬魚相對于小鼠模型具有許多優(yōu)勢,斑馬魚疾病模型的進一步發(fā)展將加速我們對疾病各種病理、生理過程的了解。隨著斑馬魚疾病模型的可用性和日益增加的多樣性,該動物系統(tǒng)將為疾病診斷,有效治療和預后提供強大的基礎(chǔ)。在高海拔地區(qū),低氧與中風或癌癥等疾病相關(guān)[34]。所以此項研究在一定程度上為探索臨床上低氧性疾病提供了新的認識和見解,但低氧究竟如何影響斑馬魚的胚胎發(fā)育和造血分化,還有待進一步研究。