付晗月，黃 旭，陸紅麗，許文燮

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖與生理學(xué)系，上海200025

應(yīng)激（stress）是指機(jī)體受到各種應(yīng)激源刺激時(shí)，出現(xiàn)以交感神經(jīng)興奮和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸激素分泌增多為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，以及由此引起的各種功能和代謝的改變［1-2］。20年來(lái)，在人類健康與疾病領(lǐng)域，針對(duì)應(yīng)激的研究占據(jù)了重要位置。應(yīng)激通常被認(rèn)為與許多種疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系，包括胃腸動(dòng)力障礙性疾病，尤其是腸易激綜合征（irritable bowel syndrome），因此受到廣泛關(guān)注［3-4］。目前關(guān)于應(yīng)激引起的結(jié)腸傳輸功能障礙的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能是多因素共同作用的結(jié)果。

結(jié)腸傳輸功能在排便過(guò)程中起著非常重要的作用，其主要?jiǎng)恿κ墙Y(jié)腸移行性復(fù)合運(yùn)動(dòng)（migrating motor complex，MMC），而結(jié)腸MMC 需要在腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）和SIP 合胞體精準(zhǔn)配合下才能完成［5］。SIP 合胞體是由平滑肌細(xì)胞、Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cell of Cajal，ICC）及血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α 陽(yáng)性細(xì)胞（platelet-derived growth factor receptor α-positive cell，PDGFRα+cell）組成的功能性合胞體。在結(jié)腸運(yùn)動(dòng)中，抑制性神經(jīng)元可通過(guò)作用于PDGFRα+細(xì)胞上的小電導(dǎo)鈣激活鉀通道3（small conductance calciumactivated potassium channel 3，SK3 通道），抑制結(jié)腸平滑肌收縮，調(diào)控結(jié)腸運(yùn)動(dòng)［6］。

蛋白酶激活受體2 （protease activated receptor 2，PAR2）是具有7 次跨膜結(jié)構(gòu)域的G 蛋白偶聯(lián)受體，參與消化道多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在胃腸道上皮功能、運(yùn)動(dòng)、炎癥的調(diào)節(jié)中起著重要作用［7-8］。PAR2 在胃腸道細(xì)胞中高表達(dá)；相比在ICC 和平滑肌細(xì)胞中，PAR2 在PDGFRα+細(xì)胞中表達(dá)較多［9］。PAR2的激活可以引起胃腸道炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胃腸動(dòng)力改變，但目前對(duì)其機(jī)制知之甚少。生理狀態(tài)下，胰蛋白酶雖然可以激活腸上皮細(xì)胞上的PAR2受體，但是腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接可以避免胰蛋白酶損害腸上皮細(xì)胞下的組織；但在病理狀態(tài)下，這種緊密連接被破壞，胰蛋白酶等蛋白酶可以進(jìn)入到黏膜層和肌層，激活PAR2受體，影響腸道運(yùn)動(dòng)、腸神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等生理過(guò)程［10］。那么，PAR2在慢性應(yīng)激引起的結(jié)腸傳輸減慢中是如何調(diào)控結(jié)腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的呢？本研究采用生理學(xué)方法觀察PAR2受體激動(dòng)劑對(duì)慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的作用，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠（8 周齡）90 只，購(gòu)自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK （滬） 2018-0007，使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2018-0027］。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度25 ℃，濕度50%～60%，12 h明暗交替環(huán)境，自由飲水進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)范。

1.1.2 主要試劑 PAR2激動(dòng)劑（2-furoyl-LIGRLOamide，2-FLA；Tocris Bioscience，英國(guó)），SK3通道阻斷劑蜂毒明肽（apamin；Tocris Bioscience，英國(guó)），anti-SK3 抗體（Abcam， 美 國(guó)）， anti-PDGFRα 抗 體（Cell Signaling Technology，美國(guó)），anti-PAR2抗體（Santa Cruz，美國(guó)）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立慢性應(yīng)激小鼠模型 將90只C57BL/6J小鼠用隨機(jī)數(shù)字卡分為慢性多源應(yīng)激刺激（chronic heterogenic stress，CHeS）處理組（n=45）和對(duì)照組（n=45），按批次制作慢性應(yīng)激小鼠模型。第1 日給予CHeS 組小鼠避水刺激90 min 后馬上放入束縛管中，4 ℃冷束縛1 h；第2日給予強(qiáng)制游泳刺激15 min 后放入束縛管中，常溫束縛1 h；如此反復(fù)14 d。而對(duì)照組小鼠不做任何處理。每天記錄應(yīng)激結(jié)束后24 h 糞便量。出現(xiàn)糞便量明顯減少，即表示建模成功。

（1）避水實(shí)驗(yàn)：在50 cm×37 cm×20 cm的容器中間放1 個(gè)2 cm×2 cm×8 cm 大小的平臺(tái)，將容器中注入水，高度為平臺(tái)下0.5 cm 處，水溫維持在室溫，將小鼠放在平臺(tái)上90 min，每2 d 1次。

（2）束縛實(shí)驗(yàn)：將小鼠放在直徑2.7 cm、高7 cm 的塑料容器中，這種大小的容器剛好可以防止小鼠翻身及移動(dòng)，容器上設(shè)置幾個(gè)孔方便小鼠呼吸。

（3）游泳實(shí)驗(yàn)：在50 cm×37 cm×20 cm的容器中注入2/3的水，水溫維持在室溫，將小鼠放在水中游泳15 min。期間觀察小鼠狀況，避免溺水。

1.2.2 結(jié)腸平滑肌肌條張力收縮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h，自由飲水。將小鼠吸入異氟烷進(jìn)行全身麻醉后，頸椎脫臼方法處死，打開(kāi)腹腔，迅速取出結(jié)腸，置于充混合氣（95% O2、5% CO2）、4 ℃的Krebs 溶液中。解剖顯微鏡下，清理結(jié)腸腸系膜和脂肪組織，并沿著腸系膜剪開(kāi)腸管，用Krebs溶液反復(fù)漂洗干凈。手術(shù)鑷撕去結(jié)腸黏膜和黏膜下層，得到完整的平滑肌肌層。沿著平滑肌肌層環(huán)形肌方向?qū)⑵交蛹舫? mm×8 mm 的肌條形狀，將肌條一端懸掛在浴槽底部金屬掛鉤上，另一端與張力換能器相連，通過(guò)微調(diào)螺旋調(diào)節(jié)肌條張力；當(dāng)肌條收縮穩(wěn)定并具有節(jié)律性時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要貼側(cè)壁緩慢加入工具藥物，進(jìn)行藥物處理。

1.2.3 Western blotting 按“1.2.2”的方法得到完整結(jié)腸后，用含蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，應(yīng)用BCA法進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣本蛋白質(zhì)濃度，保證上樣量一致。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，用Bio-Rad轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉90 min，加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌3次（每次10 min），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗常溫孵育90 min，PBST 洗滌3 次（每次10 min）；化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯色后，掃描各免疫印跡條帶并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參用Quantity One-4.6.2 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CorelDRAW 9 作圖，正態(tài)分布的定量資料采用x±s 表示，使用t 檢驗(yàn)進(jìn)行2 組樣本間比較，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性應(yīng)激模型小鼠建立

慢性多源應(yīng)激刺激誘導(dǎo)的慢性應(yīng)激小鼠模型，排便量結(jié)果見(jiàn)圖1。建模14 d，末次慢性應(yīng)激小鼠應(yīng)激刺激結(jié)束后24 h糞便排出量明顯減少，2 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

2.2 慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌組織PDGFRα 和SK3 蛋白表達(dá)

圖1 對(duì)照組和CHeS組小鼠14 d排便量比較(n=6)Fig 1 Comparison of fecal output in 14 days between the control group and CHeS group(n=6)

既然慢性應(yīng)激能使結(jié)腸傳輸減慢，本實(shí)驗(yàn)首先觀察了主要與結(jié)腸傳輸抑制性調(diào)節(jié)有關(guān)的PDGFRα 細(xì)胞及其表達(dá)的SK3 通道的變化。利用Western blotting 實(shí)驗(yàn)，觀察了近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌組織中PDGFRα 和SK3 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：慢性應(yīng)激小鼠近端結(jié)腸平滑肌組織中PDGFRα 表達(dá)增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），但SK3 表達(dá)無(wú)明顯變化（圖2）；遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌組織中PDGFRα 和SK3 蛋白表達(dá)均有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖2 CHeS組和對(duì)照組小鼠近端結(jié)腸組織PDGFRα和SK3的表達(dá)Fig 2 Expressions of PDGFRα and SK3 in the proximal colonic smooth muscles of the CHeS group and control group

2.3 SK3通道阻斷劑對(duì)應(yīng)激模型小鼠結(jié)腸平滑肌收縮的影響

慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸PDGFRα 的表達(dá)相比對(duì)照組小鼠有所增加，但PDGFRα+細(xì)胞上的SK3 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。于是，我們觀察了SK3 通道阻斷劑對(duì)對(duì)照組和CHeS組小鼠近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響。結(jié)果顯示：SK3 通道阻斷劑對(duì)小鼠近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮具有明顯的興奮作用，與給藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，圖4），但這種興奮作用在CHeS 組小鼠與對(duì)照組小鼠之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明，CHeS 組小鼠結(jié)腸平滑肌SIP 合胞體的PDGFRα+細(xì)胞上的SK3通道功能上也無(wú)明顯變化。

2.4 慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌組織PAR2蛋白表達(dá)

圖3 CHeS組和對(duì)照組小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織PDGFRα和SK3的表達(dá)Fig 3 Expressions of PDGFRα and SK3 in the distal colonic smooth muscles of the CHeS group and control group

圖4 SK3阻斷劑對(duì)CHeS組和對(duì)照組小鼠離體結(jié)腸平滑肌收縮的影響Fig 4 Effect of SK3 antagonist on contractions of colonic smooth muscle in the CHeS group and control group in vitro

PDGFRα+細(xì)胞除作為消化道中嘌呤能神經(jīng)遞質(zhì)作用的靶細(xì)胞外，還可以通過(guò)其表達(dá)的蛋白酶激活受體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［11-14］。鑒于PAR2在胃腸道細(xì)胞中的高表達(dá)以及在胃腸道運(yùn)動(dòng)、炎癥調(diào)節(jié)中的重要作用，我們利用Western blotting 觀察了近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌組織中PAR2 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果見(jiàn)圖5，在慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌組織中PAR2 表達(dá)較對(duì)照小鼠明顯增加（P=0.000）。

2.5 PAR2激動(dòng)劑對(duì)慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌收縮的影響

上述結(jié)果說(shuō)明，慢性應(yīng)激使結(jié)腸平滑肌組織PAR2 表達(dá)增多。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其功能是否同時(shí)發(fā)生了變化，我們?cè)趯?duì)照組和CHeS組小鼠結(jié)腸離體平滑肌標(biāo)本上，觀察了PAR2 激動(dòng)劑2-FLA 對(duì)結(jié)腸平滑肌收縮的影響。結(jié)果顯示：PAR2 受體激動(dòng)劑對(duì)小鼠結(jié)腸平滑肌的收縮有明顯抑制作用，給藥前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；這種抑制作用在CHeS組與對(duì)照組小鼠結(jié)腸平滑肌之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，圖6）。以上結(jié)果說(shuō)明，慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌PAR2受體的功能明顯增強(qiáng)。

圖5 慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸組織PAR2表達(dá)的變化Fig 5 Expressions of PAR2 in the colonic smooth muscles of the CHeS group and control group

圖6 PAR2激動(dòng)劑對(duì)CHeS組和對(duì)照組小鼠離體結(jié)腸平滑肌收縮的影響Fig 6 Effect of PAR2 agonist on contractions of colonic smooth muscle in the CHeS group and control group in vitro

3 討論

PDGFRα+細(xì)胞位于胃腸道平滑肌層，與抑制性腸神經(jīng)元及平滑肌細(xì)胞密切接觸，介導(dǎo)結(jié)腸傳輸?shù)囊种菩哉{(diào)節(jié)。PDGFRα+細(xì)胞作用主要有：①介導(dǎo)嘌呤能抑制性神經(jīng)對(duì)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。②通過(guò)蛋白酶激活受體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［11-14］。其中，嘌呤能抑制性效應(yīng)是通過(guò)激活PDGFRα+細(xì)胞上的apamin 敏感的SK3 通道介導(dǎo)的。作為神經(jīng)與平滑肌之間傳遞信息的細(xì)胞，PDGFRα+細(xì)胞上的SK3 通道被激活后，可產(chǎn)生自發(fā)性瞬間外向電流（spontaneous instantaneous outward current，STOC），即細(xì)胞內(nèi)的K+大量外流，細(xì)胞膜電位發(fā)生超極化，這種電活動(dòng)可通過(guò)縫隙連接作用于平滑肌細(xì)胞誘導(dǎo)其發(fā)生超極化，引起平滑肌舒張［15-16］。間質(zhì)細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間電位變化的傳遞是促使平滑肌收縮和舒張并將糞便從近端向遠(yuǎn)端結(jié)腸推進(jìn)的主要?jiǎng)恿?lái)源［17-19］。

在生理和病理?xiàng)l件下PAR2 對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)的調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，PAR2 激動(dòng)劑對(duì)結(jié)腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的調(diào)控表現(xiàn)為雙相反應(yīng)：短暫的超極化和舒張反應(yīng)，隨后是復(fù)極化和收縮反應(yīng)。收縮反應(yīng)主要通過(guò)平滑肌細(xì)胞上PARs-Gq/11-PLC 通路，增加肌醇三磷酸（IP3）的產(chǎn)生和胞內(nèi)鈣濃度［20］；而舒張反應(yīng)主要通過(guò)激活PDGFRα+細(xì)胞中的SK3 通道來(lái)介導(dǎo)［9］，且舒張反應(yīng)可被apamin 阻斷。本研究主要以PDGFRα+細(xì)胞（PAR2/SK3）-平滑肌軸為主線探討慢性應(yīng)激引起結(jié)腸傳輸減慢的機(jī)制。

參照經(jīng)典應(yīng)激模型動(dòng)物建模方法，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用避水實(shí)驗(yàn)、束縛、強(qiáng)迫游泳多源應(yīng)激構(gòu)建慢性應(yīng)激小鼠模型。在造模過(guò)程中，每天記錄應(yīng)激結(jié)束24 h 糞便量。建模14 d 后，應(yīng)激小鼠出現(xiàn)明顯胃腸動(dòng)力障礙癥狀，排便數(shù)量明顯減少。Western blotting結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌組織PDGFRα 表達(dá)增加，但PDGFRα+細(xì)胞上的SK3 表達(dá)沒(méi)有明顯變化。在結(jié)腸離體平滑肌收縮實(shí)驗(yàn)中，SK3通道阻斷劑apamin對(duì)CHeS組小鼠和對(duì)照組小鼠結(jié)腸平滑肌的增強(qiáng)作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌PDGFRα+細(xì)胞上的SK3 通道功能未發(fā)生明顯變化。以上結(jié)果表明，慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌組織PDGFRα表達(dá)雖然增加，但SK3無(wú)明顯變化。

PAR2在PDGFRα+細(xì)胞高密度分布，病理生理過(guò)程中PAR2 表達(dá)的改變可能影響胃腸道平滑肌的興奮性。Western blotting結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌組織PAR2 高表達(dá)。同時(shí)，在結(jié)腸離體平滑肌收縮實(shí)驗(yàn)中，PAR2 激動(dòng)劑2-FLA 可以抑制平滑肌收縮，且對(duì)慢性應(yīng)激小鼠結(jié)腸平滑肌的抑制作用更加明顯。以上結(jié)果提示PAR2 可能通過(guò)PDGFRα+細(xì)胞-SK3 參與調(diào)節(jié)結(jié)腸平滑肌收縮，使其收縮減弱。

綜上所述，慢性應(yīng)激可以使小鼠結(jié)腸傳輸減慢，影響排便功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在慢性應(yīng)激狀態(tài)下結(jié)腸平滑肌組織PDGFRα和其上表達(dá)的PAR2表達(dá)水平增加，并且PAR2受體激動(dòng)劑對(duì)結(jié)腸平滑肌作用較正常小鼠明顯增強(qiáng)。以上結(jié)果提示，慢性應(yīng)激使小鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)減弱且傳輸減慢，這可能與慢性應(yīng)激引起的PAR2表達(dá)增多、功能上調(diào)，從而激活PDGFRα+細(xì)胞上的SK3通道有關(guān)。因此，PAR2 可作為治療慢性應(yīng)激導(dǎo)致的結(jié)腸傳輸減慢疾病的潛在藥物篩選靶點(diǎn)之一。