徐 寧，周 甜，侯國(guó)俊，沈 南，唐元家

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕病科，上海市風(fēng)濕病學(xué)研究所，上海200127

全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）報(bào)道了許多疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP） 位點(diǎn)［1-2］，且進(jìn)一步研究［3-4］發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)大多位于具有調(diào)控活性的非編碼區(qū)。由于技術(shù)手段的限制，對(duì)上述位點(diǎn)功能性的驗(yàn)證和機(jī)制的研究?jī)H通過(guò)大樣本相關(guān)性分析或雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)等較為簡(jiǎn)單又粗糙的方式進(jìn)行，尚無(wú)法提供能夠直接驗(yàn)證SNP功能的證據(jù)［5-6］。然而，規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序 列/相 關(guān) 蛋 白9 ［clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR associated protein 9，CRISPR/Cas9］ 基因組編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)改變了這一現(xiàn)狀［7］。該系統(tǒng)由負(fù)責(zé)靶向基因組的單鏈導(dǎo)向RNA（single guide RNA，sgRNA） 與負(fù)責(zé)對(duì)基因組切割的Cas9 組成。在sgRNA 的作用下，Cas9 蛋白可誘導(dǎo)靶點(diǎn)DNA 序列處形成雙鏈斷裂（double-stranded break，DSB），隨后經(jīng)非同源末端連接（non-homologous end joining， NHEJ） 或 同 源 重 組 （homologous recombination，HR）修復(fù)途徑分別產(chǎn)生位點(diǎn)敲除/插入或位點(diǎn)重組的細(xì)胞株，而這些細(xì)胞株則可為疾病易感位點(diǎn)的功能研究提供最直接的證據(jù)［8］。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種復(fù)雜的自身免疫病。GWAS 報(bào)道顯示多個(gè)SNP 位點(diǎn)均與SLE 的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，但大多數(shù)功能未明。因此，利用CRISPR/Cas9 基因組編輯系統(tǒng)對(duì)這些位點(diǎn)的功能性進(jìn)行驗(yàn)證可直觀地了解其與疾病的關(guān)系。研究［9-11］發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的異?；罨荢LE的重要特征之一，且miR-146a 是干擾素信號(hào)通路強(qiáng)有力的負(fù)調(diào)控分子，在SLE 患者的單核細(xì)胞中異常低表達(dá)。GWAS 發(fā) 現(xiàn)SNP rs2431697 是SLE 的 易 感 位 點(diǎn) 之 一［12］，表達(dá)數(shù)量性狀位點(diǎn)（expression quantitative trait locus，eQTL）分析發(fā)現(xiàn)在歐洲人群中rs2431697 等位基因的變化會(huì)影響miR-146a 的表達(dá)［13］。故而推測(cè)，rs2431697 或其連鎖位點(diǎn)可能存在對(duì)miR-146a 的調(diào)控作用［14］。借助HaploReg數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php）對(duì)rs2431697 連鎖位點(diǎn)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，SNP rs1978421 與之存在強(qiáng)連鎖效應(yīng)（r2=0.94）。而后，本課題組分別對(duì)rs2431697 與rs1978421 SNP 處的組蛋白修飾信號(hào)進(jìn)行分析（數(shù)據(jù)源自ENCODE 數(shù)據(jù)庫(kù)），結(jié)果顯示在這2個(gè)位點(diǎn)處均探測(cè)到常見于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性區(qū)域的組蛋白H3 第4 位賴氨酸單甲基化（H3K4me1）和組蛋白H3 第27 位賴氨酸乙?；℉3K27ac）修飾信號(hào)，故而認(rèn)為這2 個(gè)位點(diǎn)都有可能位于具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的DNA 元件上，具備參與miR-146a 表達(dá)調(diào)控的能力。因此，本研究以rs1978421 為研究對(duì)象，采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)在單核細(xì)胞系U-937中研究該位點(diǎn)是否參與miR-146a 的表達(dá)調(diào)控，并以此來(lái)構(gòu)建研究非編碼區(qū)疾病相關(guān)SNP功能的有效方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株 HEK293T 細(xì)胞和U-937 細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。經(jīng)鑒定，該2種細(xì)胞無(wú)支原體污染。

1.1.2 主要儀器與試劑 DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）以及Opti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)NeonTMTransfection System、LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑以及TRIzol 試劑（Invitrogen，美國(guó)），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），TaqManTMmiRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miR-146a 與 對(duì) 照RNU48 定 量 探 針、TaqManTMmiRNA 定量試劑盒（Thermo，美國(guó)），PrimeScriptTMRT 試劑盒與TB Green?Premix Ex TaqTM試 劑 盒（TaKaRa，日本），ViiATM7熒光定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)），質(zhì)粒pSpCas9（BB）-2A-GFP（#PX458；Addgene，美國(guó)），細(xì)胞株基因型鑒定試劑盒TransDirect?Animal Tissue PCR Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司），I-5TM2×High-Fidelity Master Mix （北京擎科生物科技有限公司），F(xiàn)ACSAria Ⅱ流式分選儀（BD 公司，美國(guó)），血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U-937 細(xì)胞采用含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，HEK293T 細(xì)胞采用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于指數(shù)生長(zhǎng)期，狀態(tài)良好。

1.2.2 U-937 野生型rs1978421 位點(diǎn)基因型鑒定 為獲得靶細(xì)胞rs1978421 位點(diǎn)等位基因同源重組的細(xì)胞系，首先需對(duì)U-937 細(xì)胞rs1978421 位點(diǎn)處的堿基類型進(jìn)行鑒定（該基因型為野生型）。取約2×105個(gè)U-937 細(xì)胞，離心后棄上清液，使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。取100 ng 基因組DNA 進(jìn)行rs1978421 位點(diǎn)的PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)采用I-5TM2×High-Fidelity Master Mix 高保真酶反應(yīng)液進(jìn)行，反應(yīng)體系（50 μL）如下：模板DNA 100 ng、引物（10 μmol/L）各2.5 μL、2×高保真酶反應(yīng)液25 μL。將各成分混合均勻后短時(shí)離心，按照說(shuō)明書中的條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列見表1，產(chǎn)物長(zhǎng)度500 bp。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)測(cè)序公司進(jìn)行取樣并測(cè)序。

表1 rs1978421位點(diǎn)鑒定引物Tab 1 Indentification primer of rs1978421 locus

1.2.3 sgRNA/Cas9 表達(dá)載體的構(gòu)建 選擇pSpCas9（BB）-2A-GFP為sgRNA/Cas9的表達(dá)載體。將其進(jìn)行酶切并電泳、回收后，與sgRNA 片段連接。利用IDT 在線sgRNA 設(shè) 計(jì) 工 具 （https：//sg. idtdna. com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM）對(duì)sgRNA 進(jìn)行設(shè)計(jì)，原則如下：①SNP 位點(diǎn)在sgRNA 序列中。②sgRNA 靶向評(píng)分（on-target score）較高、脫靶評(píng)分（off-target score）較低?；谠撛瓌t，我們選取了靶向評(píng)分為71 分、脫靶評(píng)分為0 分的sgRNA，并以單鏈的形式合成（序列見表2）。將合成的sgRNA 正鏈與負(fù)鏈在體外復(fù)性為雙鏈后，與上述酶切載體于4 ℃連接過(guò)夜，而后行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，次日挑取單菌落進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序成功的菌株抽提px458-rs1978421質(zhì)粒備用。

表2 sgRNA功能序列及單鏈引物Tab 2 sgRNA functional sequence and single strand primers

1.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 于轉(zhuǎn)染前1 d 向24 孔板加入HEK293T細(xì)胞，每孔2×105個(gè)，過(guò)夜培養(yǎng)后即可行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。向每孔添加LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑2 μL，其余操作均參照說(shuō)明書進(jìn)行。當(dāng)轉(zhuǎn)染結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 即可行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將U-937細(xì)胞離心去培養(yǎng)基后，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，計(jì)數(shù)后進(jìn)行分裝，即每1.5 mL 離心管中加入1.5×106個(gè)細(xì)胞。離心后棄上清液并用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸，加入10 μg px458-rs1978421質(zhì)粒（1 μg/μL）以及30 μg單鏈DNA 重組模板（序列見表3），電轉(zhuǎn)條件為1 400 mV、10 ms、3 pulse。在電轉(zhuǎn)后的第12 h加入DNA 連接酶Ⅳ的抑制劑Scr7（終濃度為1 μmol/L），以抑制NHEJ 途徑對(duì)細(xì)胞雙鏈DNA斷裂的修復(fù)。

1.2.5 T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ實(shí)驗(yàn) 收集經(jīng)px458-rs1978421質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h 后的HEK293T 細(xì)胞，提取基因組DNA 后經(jīng)PCR 反應(yīng)對(duì)包含SNP 位點(diǎn)的片段進(jìn)行擴(kuò)增。取經(jīng)純化后的產(chǎn)物300 ng 進(jìn)行復(fù)性，反應(yīng)體系為15 μL，包含1.5 μL T7 核酸內(nèi)切酶Ⅰ（T7 endonuclease Ⅰ，T7EⅠ）緩沖液；反應(yīng)條件如下：95 ℃保持10 min，后以2 ℃/s 的速度降至85 ℃，再以0.3 ℃/s 的速度降至25 ℃，以25 ℃保持10 s后正常降溫至4 ℃。待反應(yīng)結(jié)束后，向每管復(fù)性產(chǎn)物加入2 μL T7EⅠ，于37 ℃孵育1 h 后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)切割效率。切割效率計(jì)算公式如下：

表3 同源重組模板序列Tab 3 Sequence of homologous recombination template

其中，I500bp、I310bp和I190bp分別為500 bp、310 bp 和190 bp條帶的熒光強(qiáng)度值。

1.2.6 RNA 抽 提 與qPCR 檢 測(cè) 使 用TRIzol 法 提 取RNA，以三氯甲烷萃取TRIzol 中的水相，并以異丙醇沉淀其中的RNA，用75%乙醇洗滌沉淀2 次后室溫晾干。待RNA 充分干燥后，用20 μL 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水進(jìn)行溶解并測(cè)定濃度，將其濃度統(tǒng)一調(diào)至50 ng/μL 后利用TaqManTMmiRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行miRNA qPCR 模板的制備，并將制備好的模板稀釋3 倍后再行定量。利用PrimeScriptTMRT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA 中的mRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋6 倍后作為qPCR 的模板。利用TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒對(duì)稀釋后的cDNA 模板進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。結(jié)果以相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCT展示。qPCR引物序列見表4。

1.2.7 細(xì)胞分選 U-937 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后即可進(jìn)行流式分選。以未轉(zhuǎn)染的U-937細(xì)胞作為陰性對(duì)照來(lái)調(diào)節(jié)電壓及相關(guān)參數(shù)；將活細(xì)胞與單個(gè)細(xì)胞依次設(shè)門圈出，通過(guò)調(diào)節(jié)異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）通道的電壓將陰性對(duì)照的細(xì)胞集中在橫坐標(biāo)103左側(cè)，即可將轉(zhuǎn)染過(guò)的U-937 細(xì)胞上樣；分選FITC 熒光通道橫坐標(biāo)103右側(cè)的FITC 陽(yáng)性的U-937 細(xì)胞群至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 個(gè)細(xì)胞。分選結(jié)束后于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約14 d后即可進(jìn)行基因型鑒定實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 細(xì)胞基因型鑒定 在分選后的第14 日，96 孔板底部已有肉眼可見的細(xì)胞群落。使用移液器將細(xì)胞群落均勻地吹打成細(xì)胞懸液，吸取5～10 μL至96孔PCR反應(yīng)板中，用來(lái)制備鑒定基因型的PCR 模板，剩余細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至24 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。模板制備采用TransDirect?Animal Tissue PCR 試劑盒，反應(yīng)體系為50 μL，包括4～8 μL 模板。其余實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

表4 qPCR引物序列Tab 4 qPCR primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 7.0 軟件對(duì)qPCR 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過(guò)非配對(duì)t檢驗(yàn)比較野生型與重組型細(xì)胞中的對(duì)應(yīng)基因表達(dá)的差異。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs1978421位點(diǎn)sgRNA設(shè)計(jì)及效率鑒定

利用CRISPR/Cas9 基因組編輯系統(tǒng)研究非編碼區(qū)SNP 位點(diǎn)的功能，具體流程如圖1A。為設(shè)計(jì)針對(duì)rs1978421 位點(diǎn)進(jìn)行同源重組的sgRNA，我們首先對(duì)U-937 細(xì)胞rs1978421 位點(diǎn)處的堿基類型進(jìn)行鑒定；結(jié)果（圖1B）發(fā)現(xiàn)在U-937 和HEK293T 細(xì)胞內(nèi)，rs1978421 位點(diǎn)的等位基因均為胸腺嘧啶（T）。之后，我們以含有T等位基因的DNA 片段進(jìn)行sgRNA 設(shè)計(jì)及載體px458-rs1978421 的構(gòu)建（圖1C）。成功獲得載體后，我們?cè)贖EK293T 細(xì)胞中對(duì)sgRNA 切割效率進(jìn)行檢測(cè)。T7EⅠ核酸內(nèi)切酶切割實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1D）顯示，目的sgRNA 在HEK293T中rs1978421位點(diǎn)的切割效率約為24%，表明該sgRNA 能夠?qū)s1978421 位點(diǎn)進(jìn)行有效切割，可以應(yīng)用于同源重組實(shí)驗(yàn)。

2.2 同源重組細(xì)胞株的構(gòu)建與鑒定

鑒于rs1978421 可能與miR-146a 的表達(dá)相關(guān)，而miR-146a 在HEK293T 中低表達(dá)，在U-937 中高表達(dá)，因此我們選擇在U-937細(xì)胞中進(jìn)行同源重組實(shí)驗(yàn)。將載體以及同源重組模板通過(guò)電穿孔方法轉(zhuǎn)入U(xiǎn)-937 細(xì)胞48 h 后，通過(guò)流式分選儀將單個(gè)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）強(qiáng)陽(yáng)性的細(xì)胞分選至96 孔板中，確保每孔只含有1 個(gè)細(xì)胞。在進(jìn)行流式分選時(shí)發(fā)現(xiàn)，活細(xì)胞中GFP 陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的2.29%（圖2A）。經(jīng)分選共得到960 個(gè)只含有1 個(gè)GFP 陽(yáng)性U-937 細(xì)胞的培養(yǎng)孔。經(jīng)2周培養(yǎng)后，有141個(gè)細(xì)胞增殖至肉眼可見的細(xì)胞群落；將rs1978421 位點(diǎn)附近的基因組DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增并測(cè)序發(fā)現(xiàn)，有86 個(gè)細(xì)胞克隆基因?yàn)殡s合子，占總數(shù)的61.0%；有25個(gè)細(xì)胞基因組未發(fā)生改變，占總數(shù)的17.7%；有9個(gè)細(xì)胞在rs1978421位點(diǎn)旁側(cè)檢測(cè)到不明來(lái)源DNA序列的插入，占總數(shù)6.4%；有15個(gè)細(xì)胞在rs1978421旁側(cè)發(fā)生不同數(shù)目堿基刪除，占總數(shù)的10.6%；另有6個(gè)細(xì)胞rs1978421位點(diǎn)的堿基成功由胸腺嘧啶（T）轉(zhuǎn)變?yōu)榘奏ぃ–），重組成功細(xì)胞數(shù)占總數(shù)的4.3%（圖2B、C和表5）。

2.3 rs1978421不同等位基因?qū)χ車虮磉_(dá)影響

rs1978421 位于5 號(hào)染色體PTTG1 基因下游約27.4×103bp 以及miR-146a 的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本miR3142HG 上游約12.1×103bp 處，其鄰近2 Mbp 區(qū)域內(nèi)的基因包括SLU7、TTC1、PWWP2A等（圖3A）。為了檢測(cè)rs1978421位點(diǎn)的調(diào)節(jié)基因，我們首先采用qPCR 法檢測(cè)miR-146a 在不同基因型細(xì)胞中的表達(dá)水平；結(jié)果（圖3B）顯示，與TT基因型相比，在CC 型、SNP 位點(diǎn)鄰近序列切除8 bp 以及SNP 位點(diǎn)鄰近序列插入65 bp 的細(xì)胞克隆中，miR-146a 表達(dá)無(wú)差異。同時(shí)，對(duì)rs1978421 鄰近的高表達(dá)基因檢測(cè)表明，不同基因型對(duì)這些基因的表達(dá)也無(wú)顯著影響（圖3C）。基于以上數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為rs1978421 位點(diǎn)可能不是一個(gè)具有功能性的調(diào)節(jié)位點(diǎn)。

圖1 非編碼區(qū)SNP位點(diǎn)研究策略及rs1978421位點(diǎn)sgRNA設(shè)計(jì)及切割效率檢測(cè)Fig 1 Research strategy for SNP located in non-coding region and rs1978421 sgRNA design and cutting efficiency test

圖2 流式分選與細(xì)胞基因型鑒定Fig 2 FACS sorting and cell clones genotype identification

表5 SNP rs1978421同源重組實(shí)驗(yàn)所得基因型細(xì)胞株匯總Tab 5 Summary of genotypes of cell lines obtained in SNP rs1978421 homologous recombination

3 討論

CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)是一種可靠的非編碼區(qū)疾病相關(guān)性SNP 功能研究手段。得益于該研究方法，許多疾病相關(guān)的功能性位點(diǎn)參與基因表達(dá)調(diào)控的方式被報(bào)道：如SNP rs1421085 等位基因的改變可加劇肥胖［15］，SNP rs11672691 等位基因的變化與前列腺癌細(xì)胞的增殖相關(guān)［16］。在本研究中，利用CRISPR/Cas9 基因組編輯系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組成功得到了rs1978421 等位基因重組的U-937 細(xì)胞克隆，通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)rs1978421 周圍基因的表達(dá)變化并以此明確了rs1978421 位點(diǎn)不是功能性的疾病易感位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)對(duì)rs1978421 和rs2431697 位點(diǎn)遺傳學(xué)數(shù)據(jù)的進(jìn)一步挖掘和分析，我們推測(cè)后者可能是參與miR-146a 的表達(dá)調(diào)控的功能性位點(diǎn)。后續(xù)我們將進(jìn)一步對(duì)這個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行功能性鑒定。

本研究在SNP 位點(diǎn)的選擇時(shí)僅以H3K4me1 與H3K27ac這2個(gè)組蛋白修飾信號(hào)作為依據(jù)，并未對(duì)SNP位點(diǎn)處的信息學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘。由于同源重組技術(shù)工作量大且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，因此對(duì)位點(diǎn)的選擇尤為重要。在位點(diǎn)選擇時(shí)，不僅要分析SNP 位點(diǎn)所在區(qū)域的組蛋白修飾情況，還要從其他角度進(jìn)行信息挖掘：如參考ENCODE 數(shù)據(jù)庫(kù)中轉(zhuǎn)錄因子Chip-seq 的數(shù)據(jù)對(duì)SNP 位點(diǎn)所在區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合情況進(jìn)行分析，或是根據(jù)Haploreg 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)SNP 位點(diǎn)處轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)以及分析SNP 等位基因的變化是否會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等信息。由于增強(qiáng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控不受基因組上距離的限制，因此在鑒定SNP 的功能性時(shí)，最好的辦法是對(duì)不同等位基因細(xì)胞株進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)比較兩者存在差異表達(dá)的基因來(lái)尋找SNP潛在的靶基因。

圖3 不同基因型細(xì)胞中rs1978421鄰近基因表達(dá)分析Fig 3 rs1978421 neighbor genes expressions analysis in cell clones with different genotypes

CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)及其衍生工具系統(tǒng)的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了基因組非編碼區(qū)調(diào)控功能的研究，如CRISPR 激活（CRISPR activation，CRISPRa）系統(tǒng)可對(duì)新的調(diào)控元件進(jìn)行鑒定［17］，CRISPR 干擾（CRISPR interference，CRISPRi） 系統(tǒng)可特異性地抑制基因表達(dá)［18］。由于這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控的系統(tǒng)均依賴于sgRNA 與基因組DNA 序列的堿基互補(bǔ)配對(duì)，因此我們?cè)O(shè)想了一種等位堿基特異性的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)：已知sgRNA 與基因組DNA之間的堿基錯(cuò)配會(huì)影響兩者之間互補(bǔ)配對(duì)效率［19-20］，那么如果能夠證明rs2431697 對(duì)miR-146a 存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，則可以把該區(qū)域作為靶點(diǎn)，利用CRISPR激活系統(tǒng)上調(diào)miR-146a 的表達(dá)，以增強(qiáng)對(duì)過(guò)度活化的干擾素信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用。sgRNA 設(shè)計(jì)策略如下：通過(guò)分析SLE患者基因組樣本確定rs2431697 位點(diǎn)在患者中的高頻堿基，以攜帶高頻堿基的DNA 片段為模板設(shè)計(jì)包含SNP 位點(diǎn)的sgRNA序列，在含有rs2431697不同等位堿基的細(xì)胞系中驗(yàn)證sgRNA 與DNA 的結(jié)合效率，篩選與攜帶高頻等位堿基的基因組DNA 結(jié)合能力強(qiáng)而與攜帶低頻等位堿基的基因組DNA結(jié)合能力弱的sgRNA。而此sgRNA設(shè)計(jì)策略使得該基因表達(dá)激活系統(tǒng)僅在攜帶SNP 風(fēng)險(xiǎn)等位基因的患者體內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)，對(duì)攜帶正常等位基因的患者則表現(xiàn)為低干預(yù)效應(yīng)或無(wú)干預(yù)效應(yīng)，以減少對(duì)其免疫穩(wěn)態(tài)的影響［21］，從而建立了一種致病等位基因特異性的干預(yù)策略。

總之，環(huán)境因素和遺傳因素共同參與了諸多疾病的發(fā)展。雖然這些疾病發(fā)生的機(jī)制仍未明確，但隨著疾病易感基因和相關(guān)位點(diǎn)的功能機(jī)制研究日趨深入，人們對(duì)疾病的理解也將會(huì)更加全面。