李艷花,閆亞平,劉曉琴,席國萍,宋國斌,肖保國,馬存根,4
1. 山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所,神經(jīng)炎癥及變性疾病基礎(chǔ)與應(yīng)用研究山西省重點實驗室,大同037009;2. 陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西安710062;3.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所,上海200040;4.山西中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室,神經(jīng)生物學(xué)研究中心,晉中030619
多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種好發(fā)于青壯年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)自身免疫性疾病,在我國發(fā)病率逐年提高[1]。目前大部分藥物只能暫時緩解癥狀,并不能達(dá)到治愈的目的。干細(xì)胞移植作為一項新的治療方法,已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點[2]。有研究[3]將過表達(dá)趨化因子受體5(C-C chemokine receptor type 5,CCR5)的神經(jīng)干細(xì)胞,通過靜脈給予實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠,發(fā)現(xiàn)CCR5能夠增強神經(jīng)干細(xì)胞向CNS炎癥部位遷徙的能力。盡管表達(dá)CCR5的神經(jīng)干細(xì)胞可以改善EAE的臨床癥狀,但癥狀改善程度仍不理想[3];可能是CNS的微環(huán)境特別是炎癥細(xì)胞因子及神經(jīng)再生抑制因子的存在,影響了外源性神經(jīng)干細(xì)胞的存活、分化和內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的動員,從而影響了療效。我們的前期研究[4]顯示,Rho激酶(Rho-kinase,ROCK)抑制劑法舒地爾(fasudil)具有減輕CNS炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)再生抑制因子信號通路、促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)入CNS 等作用,可提升神經(jīng)干細(xì)胞對帕金森病模型小鼠的治療效果。但fasudil聯(lián)合過表達(dá)CCR5的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是否能夠提升對MS的治療效果,目前未見報道。本研究以小鼠EAE模型作為研究人類MS的動物模型,將fasudil 作為MSCs 移植的伴侶,探討fasudil 聯(lián)合過表達(dá)CCR5 的MSCs(CCR5-MSCs)對EAE 的治療效果。
1.1.1 主要試劑 髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白第35~55位肽片段(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55,MOG35-55;Genscript,美 國),弗 氏 完 全 佐 劑(Sigma,美國),百日咳毒素(Enzo Life Sciences,美國),包埋劑(櫻花,日本),抗神經(jīng)巢蛋白(nestin)抗體、抗神經(jīng)/膠質(zhì)抗原2(nerve/glial antigen 2,NG2)抗體、抗甘油 醛 -3- 磷 酸 脫 氨 酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(Cell Signaling,美國),抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF) 抗體(Epitomics,美國),抗神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin-3,NT-3)抗體、抗神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)抗體(Abcam,美國),抗膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)抗體(Epitomics,美國),辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠、抗兔、抗大鼠二抗(Thermo Scientific,美國),熒光素(Alexa Fluor?405、Alexa Fluor?647 和Alexa Fluor?594) 標(biāo) 記 的二抗(Jackson ImmunoResearch,美國),聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美國),脫脂奶粉(BD,美國),化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore,美國),透明質(zhì)酸(Sigma,美國),fasudil(天津紅日藥業(yè)有限公司贈送),NheⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶(Thermo Scientific,美國),慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒、慢病毒滴度檢測試劑盒(SBI,美國)。
1.1.2 主要儀器 低溫高速離心機(Sigma,美國),熒光顯微鏡(Olympus,日本),酶標(biāo)儀(BioTek,美國),超聲波破碎儀(Wiggens,德國),SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)印裝置、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、PCR 儀、流式細(xì)胞儀(Bio-Rad,美國)。
1.1.3 動物、菌株和細(xì)胞 8~9周齡雌性健康C57BL/6小鼠32只,體質(zhì)量18~20 g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司。生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2019-0008,使用許可證號SYXK(晉) 2018-0002。結(jié)核分枝桿菌H37Ra(Difco,美國),人胚腎293TN細(xì)胞(SBI,美國)。
1.2.1 EAE模型制備及動物分組 所有小鼠后頸部皮下注射0.2 mL MOG35-55乳化液(包含弗氏完全佐劑100 μL、MOG35-55300 μg、滅活的結(jié)核分枝桿菌400 μg),完成免疫。免疫當(dāng)日和48 h 后,每只小鼠腹腔注射百日咳毒素250 ng。自免疫后次日開始進(jìn)行小鼠體質(zhì)量檢測和臨床癥狀評分。癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)為國際通用5分評分制:0分,無癥狀;1分,尾部張力消失;2分,一側(cè)后肢無力;3分,雙后肢癱瘓;4分,被動翻身后不能恢復(fù);5分,瀕臨死亡或死亡。動物飼養(yǎng)和處理符合山西大同大學(xué)動物倫理相關(guān)規(guī)定。
建模成功后,按體質(zhì)量將EAE 模型小鼠隨機分為EAE 模型組(腹腔注射生理鹽水)、fasudil 干預(yù)組(腹腔注射fasudil)、CCR5-MSCs 干預(yù)組(鼻腔給予CCR5-MSCs)、fasudil 聯(lián) 合CCR5-MSCs 干 預(yù) 組(鼻 腔 給 予CCR5-MSCs,并腹腔注射fasudil),每組8 只。CCR5-MSCs給予方法:在MOG35-55免疫后的第12 日,將CCR5-MSCs 干預(yù)組和fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)組小鼠麻醉后,手持小鼠使其鼻腔與頸部連線垂直地面,每鼻孔給予3 μL 透明質(zhì)酸(含100 個活性單位);之后緩慢給予12 μL CCR5-MSCs(細(xì)胞總數(shù)為1.5×105),期間允許小鼠主動吸入細(xì)胞懸液。fasudil給予方法:在MOG35-55免疫后的第14~27 日,fasudil 干預(yù)組和fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs干預(yù)組腹腔注射fasudil 400 μg,每日1次。EAE模型組以同樣方式給予生理鹽水作為對照。
1.2.2 MSCs 獲取 將小鼠無痛斷頸處死,70%乙醇消毒,無菌條件下分離后肢,去除肌肉組織;于關(guān)節(jié)處斷開股骨,5 mL注射器吸取4 mL培養(yǎng)液,從股骨一端吹出骨髓組織,清洗2次;37 ℃、5%CO2條件下,以含2%B27無血清添加劑、20 ng/mL表皮生長因子、20 ng/mL堿性成纖維生長因子的DMEM/F-12 培養(yǎng)液培養(yǎng)。按照1×106/mL的密度將細(xì)胞種植于25 mL培養(yǎng)瓶,每4 d換液1次。2周后,獲取MSCs細(xì)胞球。細(xì)胞球經(jīng)Accutase細(xì)胞消化液消化成單細(xì)胞懸液,1︰3 稀釋傳代,每3 d 傳代1 次,直到第5~10代,細(xì)胞球被消化成單細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。
1.2.3 載體構(gòu)建及質(zhì)粒獲取 根據(jù)小鼠Ccr5 基因(NM_009917)的蛋白編碼序列(coding sequence,CDS)設(shè)計引物,上游引物序列為5'-AAAGCTAGCATGGATTTTCAAGGGTCAGTTC-3',下游引物序列為5'-AAAGCGGCCGCTCATAAACCAGTAGAAACTTCAT-3'。從反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中,擴增得到Ccr5 的CDS,通過中間載體(pGEM-T)進(jìn)行擴增和測序。隨后通過NheⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶將Ccr5 的CDS 連入表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-cop-GFP。使用質(zhì)粒抽提試劑盒獲取高純度pCDH-CMVMCS-EF1-cop-CCR5-GFP質(zhì)粒,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.4 慢病毒制備及轉(zhuǎn)染 依據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作,將293TN 細(xì)胞按照7×106~8×106/mL 的密度種植于15 cm 培養(yǎng)皿,培養(yǎng)18~24 h 待細(xì)胞達(dá)到60%~80%的融合度。將45 μL包裝質(zhì)粒混合液(pPACKH1)和4.5 μg目的質(zhì)粒加入1.0~1.6 mL 無血清DMEM 培養(yǎng)液中,混勻,再加入55 μL轉(zhuǎn)染試劑(PureFection),渦旋10 s,室溫孵育15 min。將其均勻懸滴于293TN細(xì)胞培養(yǎng)液中,混勻,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~24 h 并換液。轉(zhuǎn)染后48 h 和72 h 收集上清液到50 mL無菌離心管中,3 000×g室溫離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液到250 mL離心管中,加入1/4體積預(yù)冷的慢病毒濃縮液(PEG-it Virus Precipitation),4 ℃冰箱中放置至少12 h。1 500×g、4 ℃離心30 min,收集慢病毒顆粒沉淀;同時收集上清液,1 500×g、4 ℃離心5 min,獲得全部慢病毒顆粒沉淀。以1/100~1/10的比例重懸慢病毒沉淀于預(yù)冷的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中,分裝后保存于-80 ℃冰箱中。使用慢病毒滴度檢測試劑盒進(jìn)行滴度測定。
將5×104MSCs 種植于24 孔板。次日,吸去培養(yǎng)液,補加500 μL 含2.5 μL 1×TransDux 溶液的培養(yǎng)液,按照不同感染復(fù)數(shù)加入慢病毒,以未轉(zhuǎn)染的MSCs作為對照。轉(zhuǎn)染后72 h,在熒光顯微鏡下檢測綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達(dá)情況。收集含有綠色熒光的細(xì)胞球,用于后續(xù)實驗。
1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析 CCR5-MSCs 細(xì)胞球經(jīng)Accutase細(xì)胞消化液消化成單細(xì)胞懸液,PBS 洗1 次,4%多聚甲醛固定10 min,之后PBS 洗1 次。加入通透液稀釋的抗nestin 抗體和抗CCR5 抗體,4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。PBS洗1 次后,加入熒光素(Alexa Fluor?405 和Alexa Fluor?647)標(biāo)記的二抗孵育1.5 h,之后PBS 洗1 次,流式細(xì)胞儀檢測nestin+CCR5+細(xì)胞數(shù)。
1.2.6 脊髓組織處理 于免疫后第28 日,向小鼠腹腔注射0.2 mL 0.3%戊巴比妥鈉溶液,待成功麻醉后將其斷頸處死。經(jīng)心臟依次灌注40 mL 生理鹽水和40 mL 4%多聚甲醛,分離脊柱,去除椎骨,2%多聚甲醛室溫固定4 h。10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水各4 h,包埋劑包埋組織,于液氮中快速冷凍。冷凍切片機切片,厚度為10 μm,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.7 固藍(lán)染色 冰凍切片經(jīng)室溫晾干后,放入固藍(lán)(luxol fast blue,LFB)染色液中,57 ℃恒溫?fù)u床溫育24 h。經(jīng)90%、70%乙醇溶液梯度復(fù)水,然后在0.05%碳酸鋰溶液和70%乙醇中反復(fù)浸泡,進(jìn)行分化。最后乙醇、50%二甲苯和100%二甲苯梯度脫水透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察髓鞘完整性。使用Image-Pro Plus 軟件分析脫髓鞘面積和脊髓總面積,計算脫髓鞘面積占脊髓總面積的百分比。
1.2.8 免疫熒光染色 冰凍切片經(jīng)PBS浸洗,用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS 封閉。加入抗nestin 抗體、抗NG2 抗體(用含1% BSA 和0.3% Triton X-100 的PBS 稀釋),4 ℃孵育過夜。PBS 洗3 次,加入熒光素Alexa Fluor?594 標(biāo)記的二抗和DAPI 染液(1 μg/mL),室溫孵育1.5 h,PBS 洗3 次。以未加一抗的樣品作為陰性對照。50%甘油水溶液封片,熒光顯微鏡采集數(shù)據(jù),使用Image-Pro Plus 軟件進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。收集經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的MSCs 細(xì)胞球,使用抗CCR5 抗體和Alexa Fluor?594 標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫熒光染色。
1.2.9 Western blotting 小鼠新鮮脊髓組織經(jīng)超聲破碎,獲取蛋白質(zhì)溶液。蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜,封閉,抗BDNF 抗體、抗NT-3 抗體、抗NGF 抗體、抗GDNF 抗體、抗GAPDH抗體分別孵育;用含0.3% Triton X-100 的PBS 洗滌后,辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育,增強化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。使用ImageLab 4.0軟件分析各蛋白條帶灰度值相對于內(nèi)參GAPDH 的比值,計算各組蛋白含量相對于EAE模型組的比值。
使用Graphpad Prism 5 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,定量數(shù)據(jù)采用x±s表示。臨床癥狀評分和體質(zhì)量的比較采用雙因素方差分析(two way ANOVA);其他數(shù)據(jù)2 組間比較使用韋爾奇校正的非配對t 檢驗,3 組或以上的比較使用Tukey多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染慢病毒的MSCs細(xì)胞球同時表達(dá)GFP蛋白和CCR5蛋白,表明轉(zhuǎn)染成功。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示nestin+CCR5+細(xì)胞數(shù)達(dá)83.5%,表明CCR5-MSCs具有神經(jīng)干細(xì)胞的特點(圖1)。
從免疫后第18 日開始,fasudil 干預(yù)組、CCR5-MSCs干預(yù)組、fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)組EAE 臨床癥狀評分較EAE 模型組明顯降低(圖2A)。Fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)比fasudil 或CCR5-MSCs 單獨干預(yù)能夠更加明顯地減輕EAE臨床癥狀,顯示了fasudil與CCR5-MSCs的疊加效果。MOG35-55免疫導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量下降。免疫后第22~24日,fasudil干預(yù)組和fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs干預(yù)組小鼠體質(zhì)量有所恢復(fù),與EAE 模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B)。在其他時間點各組體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
脊髓冰凍切片LFB染色結(jié)果顯示,MOG35-55免疫導(dǎo)致明顯的脫髓鞘現(xiàn)象,fasudil 干預(yù)、CCR5-MSCs 干預(yù)、fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)均能抑制髓鞘脫失,并且fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)比其他單獨干預(yù)能夠更明顯地減輕脫髓鞘現(xiàn)象,顯示了fasudil 與CCR5-MSCs 疊加的髓鞘保護效果(圖3)。
圖1 表達(dá)CCR5的慢病毒在MSCs中的轉(zhuǎn)染效率Fig 1 Transfection efficiency of CCR5 lentivirus in MSCs
圖2 Fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs對EAE臨床癥狀的影響Fig 2 Effect of fasudil combined with CCR5-MSCs on the clinical symptoms of EAE
圖3 Fasudil聯(lián)合CCR5-MSCs對脫髓鞘的抑制作用Fig 3 Inhibitory effect of fasudil combined with CCR5-MSCs on demyelination
脊髓冰凍切片免疫熒光染色結(jié)果顯示,在EAE 模型組、CCR5-MSCs 干預(yù)組中均沒有nestin+細(xì)胞(神經(jīng)干細(xì)胞) 和NG2+細(xì)胞(少突膠質(zhì)前體細(xì)胞) 出現(xiàn),但在fasudil 干預(yù)組、fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)組中出現(xiàn)大量的nestin+細(xì)胞和NG2+細(xì)胞,而且fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs干預(yù)組中nestin+細(xì)胞和NG2+細(xì)胞數(shù)目比單獨fasudil干預(yù)組明顯增多(圖4)。
Western blotting結(jié)果顯示,EAE模型組中神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF、NGF 和NT-3的表達(dá)量均較低,fasudil干預(yù)組中NGF 和NT-3 的表達(dá)明顯增加,CCR5-MSCs 干預(yù)組各神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)沒有明顯變化,fasudil 聯(lián)合CCR5-MSCs 干預(yù)使得BDNF、GDNF、NGF 和NT-3 的表達(dá)量明顯升高(圖5)。
EAE 是國際上公認(rèn)的研究MS 的一種動物模型。經(jīng)MOG35-55免疫后,小鼠脊髓組織可出現(xiàn)明顯的脫髓鞘現(xiàn)象。骨髓中存在的MSCs具有自我更新、高度增殖和多系分化能力,同時具有取材方便、可進(jìn)行自體移植、容易體 外 擴 增 的 優(yōu) 點[5]。Karussis 等[6]使 用MSCs 治 療 了15 例MS 和19 例肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS),6~25個月的隨訪結(jié)果顯示MSCs能夠逃避宿主免疫應(yīng)答,到達(dá)腦膜、蛛網(wǎng)膜下腔和脊髓組織,能明顯降低臨床癥狀評分,對MS和ALS顯示出良好的治療效果,且具有較高的安全性。MSCs可能通過免疫調(diào)節(jié)作用治療EAE[7-9]。
雖然大量研究顯示MSCs治療EAE/MS 有效,但治療效果仍不夠理想。其原因可能包括:①經(jīng)靜脈注射的MSCs通過血液循環(huán)進(jìn)入并分布于全身多個器官,最終進(jìn)入CNS 所需的時間長、效率低。②EAE/MS 損傷過程中,CNS 出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和大量的神經(jīng)再生抑制因子,從而抑制了MSCs 的存活、增殖和功能發(fā)揮。因此,為提高M(jìn)SCs 移植的療效,需要綜合考慮干細(xì)胞移行、CNS 微環(huán)境等諸多因素。Yang 等[3]將表達(dá)CCR5 的慢病毒轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞,然后靜脈給予EAE 小鼠,增強了神經(jīng)干細(xì)胞向CNS 炎癥部位遷徙的數(shù)量和速度,治療效果明顯優(yōu)于單純用神經(jīng)干細(xì)胞的對照組;該研究認(rèn)為過表達(dá)CCR5 的神經(jīng)干細(xì)胞在EAE 發(fā)病早期進(jìn)入CNS,通過其有效的免疫調(diào)節(jié)作用,減輕了CNS 的炎癥反應(yīng),從而阻止了髓鞘和神經(jīng)元的損傷,同時也有利于髓鞘再生。另外,也有研究[10]顯示鼻腔給予成體神經(jīng)干細(xì)胞可以降低EAE 的臨床癥狀;細(xì)胞經(jīng)嗅部黏膜吸收進(jìn)入腦脊液,繞過血腦屏障直接進(jìn)入CNS,也可以通過血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)、三叉神經(jīng)、視神經(jīng)等間接通路進(jìn)入腦內(nèi),有效地發(fā)揮治療作用。相較于尾靜脈、腹腔和腦立體定位注射途徑,細(xì)胞經(jīng)鼻腔途徑進(jìn)入CNS 的速度更快,數(shù)量更多,治療效果也更好[11],因此被廣泛應(yīng)用于CNS 疾病治療的研究[12-14]。
本研究通過鼻腔途徑,將CCR5-MSCs于EAE發(fā)病初期給予小鼠,發(fā)現(xiàn)其能明顯地降低EAE的臨床癥狀評分,減少髓鞘的丟失;但是EAE 發(fā)病過程中,CNS 內(nèi)的不良微環(huán)境可能限制MSCs發(fā)揮更好的治療作用。小分子化合物干預(yù)在干細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用已成為生命科學(xué)領(lǐng)域 的 熱 點[12]。ROCK 抑 制 劑,如Y-27632、fasudil、pyrintegin 和thiazovivin,具有促進(jìn)干細(xì)胞增殖、存活和抑制干細(xì)胞分化的作用[12,15]。課題組前期使用fasudil 聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞治療EAE 和帕金森病模型小鼠的實驗中,發(fā)現(xiàn)給予fasudil能明顯增加神經(jīng)干細(xì)胞在CNS內(nèi)的數(shù)量,提升神經(jīng)干細(xì)胞抗炎、抗氧化能力,從而達(dá)到良好的治療效果[4,16]。
本研究中,在給予CCR5-MSCs 之后給予fasudil,EAE 的臨床癥狀評分更低,髓鞘丟失更少。單獨給予CCR5-MSCs時內(nèi)源性nestin+和NG2+干細(xì)胞未被動員,聯(lián)合fasudil 干預(yù)之后nestin+和NG2+干細(xì)胞動員能力明顯強于單獨fasudil 干預(yù)組,說明fasudil 激發(fā)了CCR5-MSCs 的神經(jīng)干細(xì)胞動員和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞動員的能力。另外,單獨給予CCR5-MSCs 并沒有促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF、NGF 和NT-3 的表達(dá),單獨給予fasudil 也僅僅增加了NGF 和NT-3 的表達(dá),但是兩者聯(lián)合卻使得BDNF、GDNF、NGF 和NT-3 的表達(dá)量極大地提升,再次說明fasudil能明顯促進(jìn)CCR5-MSCs的神經(jīng)保護作用。
綜上所述,fasudil聯(lián)合鼻腔途徑給予過表達(dá)CCR5 的MSCs,可發(fā)揮神經(jīng)保護和促髓鞘再生的作用,明顯提升EAE的治療效果。
上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)2021年1期