張宏宏，盧海麗，陳 媛，康 娜

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧 530021）

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）于1960 年由Groves[1]首次從牛乳中分離獲得，由689個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為70～80 ku[2]。它廣泛存在于外分泌液或血漿、中性粒細(xì)胞中，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族[3-5]。有研究表明，LF 是一種具有抗炎、抗微生物和免疫功能的多效因子[6-7]。此外，LF在骨代謝方面的作用也逐漸受到關(guān)注。LF 不僅能夠增強(qiáng)成骨前體細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡，還可以抑制破骨細(xì)胞生成，降低破骨細(xì)胞活性[8-10]。鑒于LF 在促進(jìn)成骨、抑制破骨方面的效果明顯，結(jié)合骨改建是正畸牙移動(dòng)的生物學(xué)基礎(chǔ)，推測(cè)LF可能影響正畸牙移動(dòng)的復(fù)發(fā)程度。目前LF 對(duì)正畸復(fù)發(fā)移動(dòng)影響的研究較少。本研究將LF灌注到大鼠體內(nèi)，探討正畸保持期間LF對(duì)牙周組織改建的影響，旨在為正畸保持期間如何快速穩(wěn)定療效提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36 只雄性SD 大鼠，8 周齡，體重（240±10）g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK 桂2014-0002），于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境濕度56%，溫度18～20 ℃，12 h 間隔照明。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 大鼠正畸牙模型的建立 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按45 mg/kg體重腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，充分麻醉后將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，在第一磨牙近中側(cè)與切牙遠(yuǎn)中側(cè)之間安裝鎳鈦拉簧（直徑0.304 8 mm），力值控制為40 g，加力21 d 后麻醉下拆除鎳鈦拉簧，并測(cè)量大鼠第一磨牙近中移動(dòng)距離，見圖1。

圖1 大鼠正畸牙移動(dòng)模型（圖片轉(zhuǎn)載自Ma等[11]）

1.3 動(dòng)物分組和大鼠復(fù)發(fā)移位距離測(cè)量 拆除加力裝置后，將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組18 只。實(shí)驗(yàn)組給予LF（85 mg/kg）灌胃，1 次/d，連續(xù)21 d，對(duì)照組給予等量生理鹽水。

分別于灌胃7 d、14 d、21 d，兩組各取6 只大鼠，麻醉處死。在加力裝置去除時(shí)和處死時(shí)制取上頜印模，灌注石膏模型，用游標(biāo)卡尺測(cè)量并計(jì)算灌胃前、后復(fù)發(fā)移位距離（即第二磨牙遠(yuǎn)中溝與第一磨牙近中溝的距離），共測(cè)量3次，取平均值。

1.4 標(biāo)本制作 大鼠處死后取上頜第一磨牙及其牙周組織，4%多聚甲醛固定24 h，沖洗，10%EDTA-2Na 溶液脫鈣6～8 周，常規(guī)脫水、包埋、切片，切片方向?yàn)榻h(yuǎn)中向縱切，厚度為（4±1）μm。

1.5 蘇木精－伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色 選取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)第一磨牙牙周組織的切片，常規(guī)二甲苯脫蠟10 min，梯度乙醇水化，蘇木精染色10 min，返藍(lán)1 min，1%伊紅染色10 min，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片。將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取兩組牙根近中側(cè)、遠(yuǎn)中側(cè)的5 個(gè)視野，觀察不同時(shí)間點(diǎn)牙周組織的變化。

1.6 抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色 選取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的第一磨牙牙周組織的切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，行TRAP染色，37 ℃避光孵育1 h，蘇木精復(fù)染2 min，中性樹脂封片。將切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取兩組牙根近中側(cè)、遠(yuǎn)中側(cè)的5個(gè)視野進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 免疫組織化學(xué)染色 選取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的第一磨牙牙周組織的切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，高溫高壓抗原修復(fù)10 min，3%H2O2孵育30 min，山羊血清室溫封閉15 min，滴加一抗骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP，1∶500，購自美國CST公司），4 ℃冰箱孵育過夜，滴加二抗（1∶1 000，購自美國CST 公司）室溫孵育15 min，DAB 顯色1 min，蘇木精復(fù)染1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。隨機(jī)選取兩組牙根近中側(cè)、遠(yuǎn)中側(cè)的5個(gè)視野，光學(xué)顯微鏡下觀察。采用Image-pro-plus 6.0 軟件分析測(cè)量平均光密度值。平均光密度值越大，蛋白陽性表達(dá)越高，陽性表達(dá)的細(xì)胞呈棕黃色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠第一磨牙近中移動(dòng)距離 鎳鈦拉簧持續(xù)加力21 d 后，實(shí)驗(yàn)牙均出現(xiàn)明顯近中移動(dòng)。實(shí)驗(yàn)組大鼠實(shí)驗(yàn)牙近中移動(dòng)距離為（1.13±0.17）mm，與對(duì)照組的（1.09±0.21）mm 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明大鼠正畸牙移動(dòng)模型建立成功。

2.2 大鼠上頜第一磨牙的復(fù)發(fā)距離 拆除鎳鈦拉簧后大鼠實(shí)驗(yàn)牙均向遠(yuǎn)中復(fù)發(fā)移動(dòng)，時(shí)間越長復(fù)發(fā)距離越大，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的復(fù)發(fā)距離均小于對(duì)照組（均P＜0.05），見表1。

表1 兩組大鼠第一磨牙復(fù)發(fā)距離比較 mm，±s，n=6

表1 兩組大鼠第一磨牙復(fù)發(fā)距離比較 mm，±s，n=6

2.3 HE 染色結(jié)果 近中側(cè)：7～21 d，兩組牙周膜間隙逐漸增寬，21 d時(shí)恢復(fù)正常，牙周膜纖維逐漸變規(guī)則，7 d 時(shí)均可見明顯的骨吸收陷窩，隨著時(shí)間延長逐漸消失，與對(duì)照組比較，隨著時(shí)間延長實(shí)驗(yàn)組牙槽骨表面更為平整，牙槽骨內(nèi)出現(xiàn)較多新骨沉積；遠(yuǎn)中側(cè)：7～21 d，兩組牙周膜間隙逐漸變狹窄，牙周膜纖維都逐漸變規(guī)則，14 d 時(shí)對(duì)照組可見少量骨吸收陷窩，與對(duì)照組比較，隨著時(shí)間延長實(shí)驗(yàn)組牙槽骨表面更為平整且出現(xiàn)新骨形成線，對(duì)照組僅有少量新骨沉積，見圖1。

2.4 TRAP計(jì)數(shù) 隨著時(shí)間延長，兩組牙根近中側(cè)、遠(yuǎn)中側(cè)破骨細(xì)胞數(shù)逐漸減少，21 d時(shí)，對(duì)照組牙根近中側(cè)破骨細(xì)胞數(shù)量稍有增多，但與7 d、14 d比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組14 d 時(shí)牙根遠(yuǎn)中側(cè)破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少，21 d 時(shí)牙根近中側(cè)、遠(yuǎn)中側(cè)破骨細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（均P＜0.05），見圖2、圖3。2.5 免疫組化染色 隨著時(shí)間延長，兩組牙根近中側(cè)、遠(yuǎn)中側(cè)BSP 表達(dá)逐漸升高；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組7 d 時(shí)牙根近中側(cè)BSP 表達(dá)異顯著升高（P＜0.05），21 d 時(shí)牙根近中側(cè)、遠(yuǎn)中側(cè)BSP 表達(dá)異顯著升高（P＜0.05），見圖4、圖5。

圖1 大鼠第一磨牙牙周組織HE染色圖（×200）

圖2 大鼠第一磨牙牙周組織的TRAP染色圖（×200）

圖3 大鼠第一磨牙牙根近中側(cè)、遠(yuǎn)中側(cè)破骨細(xì)胞數(shù)量比較

圖4 大鼠第一磨牙牙周組織的IHC染色圖（×200）

3 討論

圖5 大鼠第一磨牙牙根近中側(cè)、遠(yuǎn)中側(cè)BSP表達(dá)比較

促進(jìn)牙槽骨成骨或抑制其發(fā)生破骨活動(dòng)可以有效減少正畸牙復(fù)發(fā)移動(dòng)[12-13]，LF是一種多效因子，其在骨代謝方面的效能尤為突出，LF一方面可以提高成骨細(xì)胞數(shù)量、加強(qiáng)成骨細(xì)胞礦化基質(zhì)的能力從而促進(jìn)成骨。另一方面，通過抑制形成于前驅(qū)細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化而抑制成骨[14-17]。Blais 等[18]與Naot等[19]認(rèn)為生理濃度的LF 能以劑量依賴性方式顯著刺激成骨樣細(xì)胞和破骨細(xì)胞系的增殖；Liu 等[8]從分子水平闡明LF 誘導(dǎo)的MC3T3-E1 成骨細(xì)胞增殖是由c-Fos 和c-Jun 通過JNK、ERK 和p38 信號(hào)通路所介導(dǎo)。本研究對(duì)大鼠拆除加力裝置后，用LF進(jìn)行灌胃，觀察其對(duì)正畸牙復(fù)發(fā)移動(dòng)的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的復(fù)發(fā)距離均較小，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異顯著（P＜0.05），表明LF 有助于抑制正畸牙移動(dòng)后的復(fù)發(fā)；此外，本研究通過HE 染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠近、遠(yuǎn)中側(cè)的新骨形成速度均較快，可能是實(shí)驗(yàn)組LF干預(yù)促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖，加快了成骨速度，使牙齒更快穩(wěn)定在新的位置，該結(jié)果與學(xué)者們的研究結(jié)果相類似。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在7～14 d 中，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的類骨小梁結(jié)構(gòu)的新生骨質(zhì)沉積，筆者推測(cè)：7～14 d的時(shí)間段是LF發(fā)揮作用的最佳時(shí)期。

BSP是骨和其他礦化組織中主要的非膠原蛋白組分，引導(dǎo)和調(diào)節(jié)骨組織礦化[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)牙近、遠(yuǎn)中側(cè)BSP 的平均光密度值均較高，在近中側(cè)，7 d、21 d 時(shí)差異顯著（P＜0.05），在遠(yuǎn)中側(cè)，21 d 時(shí)差異顯著（P＜0.05）。有學(xué)者使用LF 對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)礦化，結(jié)果顯示，LF可以有效促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化成熟[21]。綜合前人的研究與本實(shí)驗(yàn)BSP 表達(dá)結(jié)果，我們推測(cè)在大鼠正畸牙復(fù)發(fā)移動(dòng)階段，LF可促進(jìn)正畸牙牙周膜內(nèi)BSP的表達(dá)，從而促進(jìn)了骨組織的礦化成熟。同樣地，在顱骨再生研究中，有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)BSP 可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，含BSP 涂層的骨缺損支架其骨形成趨勢(shì)明顯增加[22-23]。

牙周骨改建受到成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞相互影響。本實(shí)驗(yàn)TRAP染色顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)牙近、遠(yuǎn)中側(cè)破骨細(xì)胞數(shù)量均較低，在近中側(cè)，21 d 時(shí)差異明顯（P＜0.05），在遠(yuǎn)中側(cè)，14 d、21 d 時(shí)有明顯差異（P＜0.05）。本課題組推測(cè)LF 在一定程度可以抑制破骨細(xì)胞的形成來抑制成骨，而且從時(shí)間點(diǎn)來推測(cè)，LF抑制破骨細(xì)胞的形成可能是一個(gè)緩慢的過程，這與Inubushi等[24]學(xué)者的研究相符。

基于上述研究結(jié)果與其他學(xué)者的結(jié)論，本文推測(cè)LF 的干預(yù)可以有效減少大鼠正畸牙復(fù)發(fā)移動(dòng)距離，促進(jìn)正畸牙牙周組織的改建。本研究豐富了LF在正畸牙復(fù)發(fā)移動(dòng)階段牙周骨改建領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)，但是，LF 對(duì)牙周骨改建的具體機(jī)制尚未了解，還需要進(jìn)一步去探索和實(shí)驗(yàn)。