詹彥婷，覃再嫩，鄭 立△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西－東盟重大疾病預(yù)防協(xié)同創(chuàng)新中心；2.廣西組織器官修復(fù)醫(yī)用生物材料工程技術(shù)研究中心，南寧 530021）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）作為一種致殘率極高的疾病，給患者精神和經(jīng)濟(jì)都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。OA 涉及整個(gè)關(guān)節(jié)的變化，包括透明軟骨進(jìn)行性丟失，軟骨下骨發(fā)育不良、骨贅和骨包膜的厚度增加[2-3]。促進(jìn)OA 發(fā)展的主要原因包括炎癥介質(zhì)過表達(dá)、降解酶的產(chǎn)生過多以及氧化應(yīng)激等。其中，活性氧(ROS)引起的氧化應(yīng)激能促進(jìn)分解代謝，從而使軟骨穩(wěn)態(tài)遭到氧化及破壞，是軟骨細(xì)胞損傷的主要原因[4]。目前，非甾體類抗炎藥（NSAIDs）和阿片類的鎮(zhèn)痛藥已被應(yīng)用于OA 的治療，然而這些藥物大部分情況下只能緩解OA 患者的癥狀，并且長(zhǎng)期使用此類藥物對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生較大的副作用[5]。因此，在OA 的治療策略上，可以采用抑制炎癥、降低氧化應(yīng)激和維持軟骨代謝平衡的方法，有助于延緩OA的進(jìn)展。

秦皮苷作為秦皮的有效成分，具有抑制炎癥反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激、降低肺血管通透性、護(hù)肝、護(hù)腎的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，秦皮苷可以通過抑制核因子κB（NF-κB）和激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）信號(hào)通路，保護(hù)小鼠免于內(nèi)毒素休克[7]。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）小鼠模型中，秦皮苷能下調(diào)炎癥基因白介素（IL）-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-1β 的表達(dá)，清除ROS，增加超氧化物歧化酶活性，從而避免氧化應(yīng)激損傷[8]。在氧嗪誘導(dǎo)的高尿酸血癥模型中，秦皮苷可以抑制腎臟中的相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體（如腎葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9 和尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1），從而使尿酸鹽的排泄增加，達(dá)到抗高尿酸血癥的目的[9]。然而，秦皮苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的OA 軟骨細(xì)胞的作用和機(jī)制目前尚未見報(bào)道。本研究旨在探討秦皮苷對(duì)炎癥環(huán)境下軟骨細(xì)胞的抗炎、抗氧化及軟骨保護(hù)作用，以期為OA的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑 秦皮苷(純度≥95%)（麥克林，中國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas Company，美國(guó)）；LPS、青/鏈霉素、MTT 試劑、總RNA 提取試劑盒、蘇木精－伊紅（HE）染色試劑盒、番紅O 染色試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）檢測(cè)試劑盒（Solarbio，中國(guó)）；二型膠原酶（Sigma，美國(guó)）；鈣黃綠素/乙錠均二聚物（Calcein-AM/EthD-I）染色試劑(百奧萊博，中國(guó))；ROS檢測(cè)試劑盒（碧云天，中國(guó)）；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13 一抗、FITC 免疫熒光抗體（博士德，美國(guó)）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；引物（金開瑞，中國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，3～5 日齡，體重10～12 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK 桂2020-0004。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：202010001。

1.3 T-AOC 檢測(cè) 使用T-AOC 檢測(cè)試劑盒評(píng)估秦皮苷的總抗氧化水平。在酸性狀態(tài)下，秦皮苷能將Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）還原，生成藍(lán)色的Fe2+-TPTZ。秦皮苷按照對(duì)倍稀釋的方法配置成不同濃度（0 μg/mL、0.3125 μg/mL、0.625 μg/mL、1.25μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、160 μg/mL）的溶液，取秦皮苷溶液30 μL，工作液900 μL 和雙蒸餾水90 μL，充分混合，室溫條件下孵育10 min，加入100 μL 的混合液于96 孔板，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)593 nm 處的吸光度（OD）值。

1.4 軟骨細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定 麻醉處死大鼠，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚，無菌操作下取下雙側(cè)股骨頭及膝關(guān)節(jié)（保留周圍肌肉，軟骨不能暴露），置于含1%的青/鏈霉素的PBS 中，去除軟骨周圍組織，將軟骨剪為1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，胰蛋白酶消化30 min，含2 mg/mL的Ⅱ型膠原酶37 ℃下消化4 h，1 000 r/min 離心5 min，收集并重懸細(xì)胞于DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每?jī)商鞊Q1次液，待細(xì)胞密度約為90%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，使用第3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過HE染色和番紅O染色法進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定。

1.5 MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖率 通過MTT法檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖率，以評(píng)價(jià)秦皮苷對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性作用，具體步驟：將軟骨細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞充分貼壁后，加入100 μL 濃度分別為0 μg/mL、0.312 5 μg/mL、0.625 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80μg/mL 的秦皮苷溶液，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，換新培養(yǎng)基，加入MTT 試劑10 μL，置于37oC 培養(yǎng)箱中，4 h 后將培養(yǎng)基棄去，加入DMSO 100μL，37oC 避光孵育15 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm 處各孔的OD 值。細(xì)胞增殖率=[(實(shí)驗(yàn)組OD－空白調(diào)零孔OD)/(對(duì)照組OD－空白調(diào)零孔OD)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞分組和干預(yù) 將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和處理組。對(duì)照組只加入完全培養(yǎng)基，模型組加入含10 μg/mL LPS 的完全培養(yǎng)基，處理組先提前1 h加入含10μg/mL LPS 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷，隨后加入5μg/mL 秦皮苷的完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞種植于6孔板中，待24 h細(xì)胞貼壁后，經(jīng)過相應(yīng)的藥物處理24 h 后，收集細(xì)胞。通過HE 染色和番紅O 染色法評(píng)價(jià)秦皮苷對(duì)LPS誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞的作用。

1.7 Calcein-AM/EthD-I 染色檢測(cè)細(xì)胞活性 將細(xì)胞爬片置于6 孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，藥物處理24 h，PBS清洗3次，加入0.05%Calcein-AM 和0.2%EthD-I染色試劑在暗室中37oC 孵育5 min，PBS 清洗掉熒光試劑，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的生存情況并拍照，用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.8 二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光探針檢測(cè)軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS 按照1∶1 000 的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA熒光探針，使終濃度為10μmol/L。棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，加入0.5 mL DCFH-DA 熒光探針稀釋液，在37oC的CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，每3～5 min混勻1次，用無血清培養(yǎng)基將爬片洗滌3遍，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，用Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度的平均值，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平越高。

1.9 免疫熒光染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞MMP-13 的分泌情況 用PBS 洗滌細(xì)胞爬片3 次后，將細(xì)胞爬片置于3% H2O2中孵育15 min，PBS 洗滌3 次，與山羊血清溫育15 min，棄去血清；滴加一抗（MMP-13，1∶100）37oC孵育4 h，PBS洗滌3次；二抗（FITC-抗兔IgG，1∶100）37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，吸去水分，熒光顯微鏡下觀察熒光圖像并拍照，用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度的平均值，綠色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，MMP-13的水平越高。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá) 提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用LightCycler?96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Roche，瑞士）進(jìn)行qPCR反應(yīng)，用GADPH作為內(nèi)參，檢測(cè)炎癥基因IL-6、MMP-3、MMP-13 和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）以及軟骨特異性基因Col2al 的表達(dá)情況。引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SKN-q檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 秦皮苷的T-AOC 在秦皮苷濃度為1.25 μg/mL時(shí)，總抗氧化水平較高（P＜0.05），并且隨著秦皮苷濃度的增加，總抗氧化水平也相應(yīng)升高（圖1），表明秦皮苷具有良好的抗氧化的能力。

圖1 秦皮苷的T-AOC

2.2 軟骨細(xì)胞的鑒定結(jié)果 HE 染色顯示：細(xì)胞形態(tài)呈多邊形或橢圓形（圖2A），符合軟骨細(xì)胞形態(tài)特征。番紅O 染色中，堿性染料與細(xì)胞蛋白多糖結(jié)合，使細(xì)胞變?yōu)榧t色（圖2B），細(xì)胞具有分泌蛋白多糖的功能，表明提取的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。

圖2 SD大鼠軟骨細(xì)胞的鑒定

2.3 秦皮苷對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性作用 秦皮苷濃度低于5μg/mL 時(shí)，對(duì)軟骨細(xì)胞無明顯毒性（P＞0.05）（圖3）。因此，選擇5 μg/mL 作為秦皮苷的工作濃度。

2.4 秦皮苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)OA 軟骨細(xì)胞的作用 HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組軟骨細(xì)胞形態(tài)正常，模型組軟骨細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型，與成纖維細(xì)胞形態(tài)類似；與模型組相比，秦皮苷處理后軟骨細(xì)胞形態(tài)改善，細(xì)胞數(shù)量顯著增加，形態(tài)接近于正常軟骨細(xì)胞（圖4），表明秦皮苷可以維持軟骨細(xì)胞的正常形態(tài)。

番紅O 染色顯示：對(duì)照組有大量蛋白多糖分泌，經(jīng)LPS 處理后，模型組顏色變淺，蛋白多糖的分泌量（紅色細(xì)胞數(shù)）顯著減少，且經(jīng)秦皮苷處理后，蛋白多糖分泌量（紅色細(xì)胞數(shù)）明顯高于模型組（圖5），說明秦皮苷可以促進(jìn)蛋白多糖的分泌。

圖3 MTT檢測(cè)秦皮苷對(duì)軟骨細(xì)胞的毒性作用

2.6 3 組軟骨細(xì)胞活力比較 與對(duì)照組比較，模型組存活細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞增殖率下降（P＜0.001）；經(jīng)秦皮苷處理后，與模型組相比，處理組存活細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞增殖率升高（P＜0.001）（圖6），表明秦皮苷能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。

2.7 3 組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平比較 與對(duì)照組比較，模型組熒光強(qiáng)度明顯提高（P＜0.001），說明細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平顯著升高；與模型組相比，處理組熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.001），說明細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平明顯降低，見圖7。

2.8 3組軟骨細(xì)胞MMP-13表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組MMP-13 的表達(dá)升高（P＜0.001）；與模型組相比，處理組MMP-13 表達(dá)明顯降低（P＜0.001），見圖8。

2.9 3組軟骨細(xì)胞特異性基因及炎癥相關(guān)基因表達(dá)比較 模型組IL-6、MMP-3、MMP-13 和iNOS 基因的表達(dá)均高于對(duì)照組(P＜0.001)，軟骨特異性基因Col2al 的表達(dá)降低（P＜0.001）。與模型組相比，處理組炎癥基因IL-6、iNOS、MMP-3 和MMP-13 的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），軟骨特異性基因Col2al的表達(dá)升高（P＜0.05）(圖9)。提示秦皮苷可以逆轉(zhuǎn)炎癥相關(guān)基因及軟骨特異基因的表達(dá)。

圖4 細(xì)胞HE染色圖（×100）

圖5 細(xì)胞番紅O染色圖（×100）

圖6 Calcein-AM/EthD-I染色檢測(cè)細(xì)胞的活性

圖7 熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS

圖8 免疫熒光染色顯示MMP-13的表達(dá)情況

圖9 特異性軟骨基因和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

OA 作為一種慢性退行性病變，多涉及關(guān)節(jié)軟骨，軟骨下骨和滑膜等部位[10]。軟骨變性的最關(guān)鍵特征是基質(zhì)降解酶（包括MMP 和蛋白聚糖）的上調(diào)。研究表明，由炎癥介質(zhì)過度表達(dá)引起的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致分解代謝酶增加，細(xì)胞外基質(zhì)降解，OA 癥和軟骨細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)了OA 的整體進(jìn)展[11]。秦皮是臨床常用的中藥，具有清熱解毒、消炎、抗氧化、抗菌、抗高尿酸血癥和平喘止咳等功能[12-14]。秦皮苷是秦皮的有效活性成分，在LPS 誘導(dǎo)的ARDS小鼠模型中，具有明顯的抗炎及抗氧化的作用。但目前尚未有研究報(bào)道秦皮苷對(duì)OA 的作用，本研究探討了秦皮苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)的體外OA 模型的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，秦皮苷具有抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解、減少炎癥介質(zhì)和抗氧化作用，在一定程度上延緩了OA的進(jìn)展。

關(guān)節(jié)軟骨周圍有大量的細(xì)胞外基質(zhì)，而基質(zhì)僅由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，一旦受損，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)源性修復(fù)困難[15]。細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是膠原和蛋白多糖，細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的不平衡是導(dǎo)致OA 的主要因素[16]。因此，維持細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝的平衡，對(duì)于OA 的治療具有至關(guān)重要的作用。MTT 結(jié)果顯示，5 μg/mL 的秦皮苷對(duì)軟骨細(xì)胞無毒性，Cal‐cein-AM/EthD-I染色結(jié)果表明，秦皮苷在該濃度下，能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡。蛋白多糖作為軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，其分泌的減少不利于軟骨的生長(zhǎng)，而蛋白多糖的分泌的增加則有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)[17]。HE 和番紅O 染色結(jié)果顯示，秦皮苷能維持軟骨細(xì)胞的正常形態(tài)，增加蛋白多糖的分泌，對(duì)軟骨起保護(hù)作用。MMPs參與膠原降解，MMP-13是軟骨分解代謝的關(guān)鍵酶，其過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解[18-19]。MMP-13 在軟骨細(xì)胞的分解代謝活動(dòng)中起著重要的作用，抑制MMP-13 的表達(dá)有助于保護(hù)軟骨[20]。本研究結(jié)果顯示，秦皮苷能抑制MMP-3和MMP-13的表達(dá)(均P＜0.05)，有利于維持軟骨分解代謝的平衡，避免細(xì)胞外基質(zhì)的降解。此外，秦皮苷可上調(diào)軟骨特異性基因Col2al的表達(dá)(P＜0.001)，提示秦皮苷能促進(jìn)Ⅱ型膠原的合成，間接促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的形成。

過量ROS 引起的氧化應(yīng)激是引起軟骨降解和OA 的主要原因，清除ROS 可以抑制氧化應(yīng)激，對(duì)OA 的治療起著重要的作用[21]。T-AOC 結(jié)果表明，秦皮苷具有良好的抗氧化性能，并且隨著秦皮苷濃度的增加，其抗氧化能力也增加。DCFH-DA 熒光探針的結(jié)果也表明了秦皮苷具有清除軟骨細(xì)胞內(nèi)ROS、抑制氧化應(yīng)激的作用。研究表明，炎癥對(duì)OA的發(fā)展起著重要的作用，炎癥因子的過度表達(dá)往往導(dǎo)致骨與軟骨的破壞[22]。因此，抑制炎癥因子的過表達(dá)有助于延緩OA 的進(jìn)展。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，秦皮苷能通過降低炎性介質(zhì)IL-1β 和IL-6 的表達(dá)，抑制JAK/STAT 和激活NF-κB 信號(hào)通路，以達(dá)到緩解肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎癥狀的目的[23]。本研究qPCR 結(jié)果顯示，秦皮苷能抑制LPS 誘導(dǎo)IL-6、iNOS的過度表達(dá)（均P＜0.05），表明秦皮苷能抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥，以發(fā)揮對(duì)軟骨的保護(hù)作用。

綜上所述，秦皮苷可以抑制炎癥因子和分解代謝基因的過表達(dá)，促進(jìn)軟骨特異性基因的上調(diào)，清除ROS，對(duì)軟骨細(xì)胞具有良好的抗炎、抗氧化和保護(hù)作用。因此，秦皮苷在LPS 誘導(dǎo)的體外OA 模型中具有抗氧化、抗炎的作用，其有望應(yīng)用于OA 的治療，作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。