莫小香，黎 驪，黃國林，宋錦靜，于 菲，韋彤彤，陽 潔Δ

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530022）

近10年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球所有類型癌癥中均位居第一[1-3]。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是我國肺癌的主要亞型，其中，85%的肺癌患者屬于腺癌[4]。與其他肺癌類型比較，NSCLC 癥狀隱匿，極易與其他肺部疾病混淆而漏診，從而導(dǎo)致患者錯(cuò)失手術(shù)治療時(shí)機(jī)[5]。盡管NSCLC 治療方式多樣，但因其進(jìn)展迅速，多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，難以采用手術(shù)治療且對(duì)可選擇的治療手段容易發(fā)生耐受，平均5 年生存率低，約為15%[3,6-7]。因此，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是NSCLC 患者遠(yuǎn)期生存率低的關(guān)鍵原因，目前抑制NSCLC 轉(zhuǎn)移的治療方式還十分有限[7-8]。

細(xì)胞遷移誘導(dǎo)透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白（cell migra‐tion inducing protein，CEMIP）是近年來被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）水解酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的蛋白[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，CEMIP 異常高表達(dá)與結(jié)直腸癌、宮頸癌、肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系，而鮮少有報(bào)道CEMIP對(duì)肺癌的影響[10-12]。因此，本研究擬在細(xì)胞水平上干預(yù)CE‐MIP 的表達(dá)，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、Western blotting、Transwell等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷移能力、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epi‐thelial-mesenchymal transition，EMT）標(biāo)志物的表達(dá)變化及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變，探究CEMIP 對(duì)NSCLC侵襲、遷移的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 NSCLC 細(xì)胞株A549、H1299 購自中科院上海研究所細(xì)胞庫，人正常肺細(xì)胞BEAS-2B 購自中科院昆明研究所細(xì)胞庫；RPMI-1640、胎牛血清購Thermo Fisher Scientific 公司；總RNA 提取試劑RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime‐Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser）、qPCR 擴(kuò)增染料（TB Green?Premix Ex Taq?II）購自TAKA‐RA 公司；CEMIP 一抗（Proteintech 公司）、GAPDH（BBI公司）、E-cadherin（CST公司）、N-cadherin（Pro‐teintech公司）、Vimentin（CST公司）、Twist1（Protein‐tech公司）、Snail1（Proteintech公司）；STAT3（CST 公司）、Src（Proteintech公司）、p-AKT（CST公司）、AKT（abcam 公司）、Alex-555-羊抗兔（BBI 公司）、羊抗兔、羊抗鼠二抗購自CST公司；CEMIP干擾慢病毒、陰性對(duì)照干擾慢病毒購自上海吉?jiǎng)P公司。

1.2 臨床標(biāo)本收集 收集2017 年8 月至2018 年8月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的6 例NSCLC患者（男4例、女2例，中位年齡66歲）經(jīng)手術(shù)切除的肺癌組織及其癌旁正常肺泡組織。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡大于18 歲；（2）ESCO 得分＜2 分；（3）病理診斷證實(shí)為NSCLC 且具有完整的病歷；（4）術(shù)前未曾接受放、化療；（5）未合并其他重大疾病。

1.3 免疫熒光染色檢測(cè)病理組織CEMIP表達(dá)情況 將病理切片置于提前預(yù)熱的烤箱，72 ℃烤片5 h，經(jīng)過二甲苯－乙醇梯度脫蠟、復(fù)水，用檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液（pH=6）進(jìn)行高壓抗原修復(fù)，高壓上汽5 min 后停止，待其降至室溫取出切片。修復(fù)后的切片用PBS 洗2 次，然后用5% BSA 室溫封閉1 h。按1∶100（CEMIP 抗體∶PBS）比例配置CEMIP一抗稀釋液，4 ℃冰箱孵育過夜，次日37 ℃復(fù)溫1 h，用PBS 洗2 次，加入熒光二抗：Alex555-羊抗兔（1∶100），37 ℃孵育1 h。PBS 洗滌后，加入DAPI 染核5 min，洗滌3 次后切片用甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡公司，Model DMi8）下觀察并拍照，記錄CEMIP 染色情況，用Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) NSCLC 細(xì)胞株A549、H1299 細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青－鏈霉素的RMPI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。肺正常細(xì)胞BEAS-2B 用含0.4%牛腦垂體提取物、0.1%氫化可的松、0.1%重組表皮生長(zhǎng)因子、0.1%腎上腺素、0.1%胰島素、0.1%轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.1%三碘甲狀腺素、0.1%視黃酸的BEBM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定干擾CEMIP 細(xì)胞株 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到24 孔板，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，每孔加入500 μL RMPI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。第2 天，吸棄原細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 洗2 次，然后每孔加入500 μL 稀釋后的病毒液，病毒滴度為5×106TU/mL，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12～24 h 后，吸棄病毒液，用PBS 洗2 次，然后加入500 μL 新鮮RMPI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。觀察細(xì)胞狀態(tài)，必要時(shí)給予換液，如果細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%則將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移到25T 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞GFP 熒光的表達(dá)情況，細(xì)胞用3 μg/mL 嘌呤霉素持續(xù)篩選2 周后，可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。通過qPCR 和Western blotting 驗(yàn)證所轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功后，將細(xì)胞分為干擾組（shCE‐MIP 組）和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照病毒的陰性對(duì)照組（shNC組）。

1.6 qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞CEMIP mRNA 表達(dá) 按照試劑說明書，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實(shí)時(shí)定量PCR 儀（ABI 7500，美國）檢測(cè)CEMIP mRNA 表達(dá)水平。CEMIP 上游引物：5’-TCGGTC‐CAAGAGTCCATTC-3’，下游：5’-CTCCATCACCACTAATCTCCC-3’；GAPDH 上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)；添加熔解曲線：95 ℃10 min，60 ℃15 s，95 ℃5 s。采用2－ΔΔct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲、遷移能力 遷移實(shí)驗(yàn)：將各組細(xì)胞預(yù)先用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h。消化收集各組細(xì)胞，用無血清RMPI-1640 培養(yǎng)基重懸成5×105個(gè)/mL濃度，每孔100 μL分別接種到Transwell 上室，并在下室加入600 μL 含10% 胎牛血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，取出小室，用棉簽擦凈濾膜上未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定30 min、0.1% 的結(jié)晶紫染色30 min，洗凈風(fēng)干，在倒置顯微鏡下觀察(200×)，取8 個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)，取均數(shù)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞遷移能力用平均細(xì)胞數(shù)/高倍鏡視野表示。

侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel 原液與無血清RMPI-1640 培養(yǎng)基按1:8 稀釋，在Transwell 小室上室加入100 μL 稀釋后的Matrigel 基質(zhì)膠，置于37 ℃培養(yǎng)箱1 h。待上室中的膠凝固后取出小室，消化收集各組饑餓處理后的細(xì)胞，用無血清RMPI-1640 培養(yǎng)基重懸成8×105個(gè)/mL 濃度，每孔100 μL 分別接種到Transwell上室，并在下室加入600 μL含10%胎牛血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，取出小室。后續(xù)處理及統(tǒng)計(jì)與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞愈合能力 預(yù)先在6 孔板底部用記號(hào)筆每隔0.5～1.0 cm均勻畫橫線，然后在6孔板中加入各組細(xì)胞，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。第2 天用10 μL 槍頭在孔板底部垂直于背后的橫線畫痕，PBS沖洗干凈后，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，移到10×光鏡下觀察各組細(xì)胞遷移情況，拍照記錄。然后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，必要時(shí)更換無血清培養(yǎng)基，并在48 h進(jìn)行拍照記錄。愈合率%=（0 h寬度?48 h寬度）/0 h寬度×100%。

1.9 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞CEMIP、EMT標(biāo)志蛋白及相關(guān)通路蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白，采用BCA 定量法測(cè)定各組細(xì)胞蛋白濃度；取30 μg的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜；5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h 后，分別加入一抗：CEMIP 抗體（1∶800）、GAPDH 抗體（1∶2 000）、Ecadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、Twist1（1∶500）、Snail1（1∶500）、STAT3（1∶500）、Src（1∶1 000）、p-AKT（1∶2 000）、AKT（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過夜；PBST 洗膜，分別加入二抗（1∶10 000或1∶30 000）室溫下孵育1 h，PBST洗膜，用雙色紅外成像系統(tǒng)（美國Licor 公司，ODYSSEY）掃膜，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CEMIP在NSCLC臨床標(biāo)本中的表達(dá) 肺癌組織中CEMIP 的表達(dá)明顯高于其配對(duì)癌旁正常肺泡組織（P＜0.05），約為1.56倍，見圖1。

2.2 CEMIP 在肺癌細(xì)胞A549、H1299 及肺正常細(xì)胞BEAS-2B 的表達(dá) 肺癌細(xì)胞A549 和H1299 的CEMIP mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著高于肺正常細(xì)胞BEAS-2B（均P＜0.05），見圖2。

2.3 干擾CEMIP后NSCLC細(xì)胞中CEMI mRNA及蛋白表達(dá) 經(jīng)嘌呤霉素穩(wěn)定篩選后，病毒的轉(zhuǎn)染效率均達(dá)90%以上。與shNC組比較，shCEMIP組CE‐MIP mRNA 及蛋白表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.001），見圖3。

2.4 干擾CEMIP 表達(dá)對(duì)NSCLC 細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 H1299、A549 細(xì)胞中shCEMIP 組的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著少于其shNC 組（均P＜0.01），見圖4。

2.5 干擾CEMIP 表達(dá)對(duì)NSCLC 細(xì)胞愈合能力的影響 H1299、A549 細(xì)胞中，shCEMIP 組細(xì)胞愈合率均顯著低于shNC組（均P＜0.001），見圖5。

2.6 干擾CEMIP表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞EMT的影響 H1299 和A549 細(xì)胞shCEMIP 組的上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著高于shNC組（P＜0.05），而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、Twist1、Snail1蛋白表達(dá)量均低于shNC組（均P＜0.05），見圖6。

2.7 干擾CEMIP 表達(dá)對(duì)NSCLC 細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路蛋白的影響 干擾CEMIP 后，H1299 和A549 細(xì)胞Src、p-AKT、AKT、STAT3 表達(dá)均呈不同程度下降（P＜0.05），見圖7。

3 討論

圖1 CEMIP在NSCLC組織樣本中的表達(dá)

圖2 CEMIP在肺癌細(xì)胞A549、H1299及肺正常細(xì)胞BEAS-2B中的表達(dá)

圖3 干擾CEMIP后NSCLC細(xì)胞中CEMIP的mRNA及蛋白表達(dá)

圖4 干擾CEMIP表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

圖5 干擾CEMIP表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞劃痕愈合能力的影響

圖6 干擾CEMIP表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平的影響

圖7 干擾CEMIP表達(dá)對(duì)NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

大量研究表明，NSCLC 細(xì)胞在一些蛋白、轉(zhuǎn)錄因子的驅(qū)動(dòng)下，通過EMT 而獲得強(qiáng)大的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EMT 是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[13]。NSCLC 細(xì)胞發(fā)生EMT 時(shí)，表現(xiàn)為失去上皮細(xì)胞特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，如極性消失、呈梭型改變；細(xì)胞間粘附減弱、運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)；上皮細(xì)胞標(biāo)記物如E-cadherin 表達(dá)下調(diào)；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物如N-cad‐herin、vimentin 等表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist、ΔEF1/ZEB1、SIP1/ZEB2、E12/E47 等表達(dá)增加[13-14]。最近，Yu 等[15]采用免疫組化檢測(cè)14 對(duì)臨床標(biāo)本中YAP1 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在具有顯著間質(zhì)表型的NSCLC 癌組織中高表達(dá)；Yang 等[16]發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)FOXP3 的NSCLC 能夠維持細(xì)胞的間質(zhì)表型，并通過激活Wnt/β-catenin 使細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移及增殖能力。Elumalai 等[17]通過敲除NSCLC細(xì)胞中PTEN 表達(dá)（PTEN-KO）發(fā)現(xiàn)，具有顯著間質(zhì)表型的PTEN-KO 細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲、遷移能力，并在裸鼠模型上驗(yàn)證PTEN-KO 細(xì)胞在體內(nèi)更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。此外，Jakobsen 等[18]發(fā)現(xiàn)，對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）耐藥的NSCLC 細(xì)胞具有很強(qiáng)的間質(zhì)表型，且間質(zhì)標(biāo)記物的高表達(dá)與不良預(yù)后呈正相關(guān)。相反地，通過抑制EMT 則能夠減緩轉(zhuǎn)移的發(fā)生。由此可見，EMT表型轉(zhuǎn)化是NSCLC 細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要過程，EMT與NSCLC的預(yù)后、轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，CEMIP 通過調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞EMT 表型轉(zhuǎn)化，驅(qū)動(dòng)其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Xu 等[19]發(fā)現(xiàn)，索拉菲尼耐藥的肝癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯地間質(zhì)化，這一現(xiàn)象與其中異常高表達(dá)的CEMIP協(xié)同EGF 誘導(dǎo)的EMT 轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。該研究還在裸鼠肝癌耐藥模型中證實(shí)，高表達(dá)CEMIP的耐藥細(xì)胞更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。具體來說，由于CEMIP含有調(diào)控EMT 的高度保守的功能域，這使得其在多種腫瘤中均能促進(jìn)EMT 進(jìn)程[20]。此外，一篇CEMIP 與肺癌相關(guān)的研究報(bào)道，NSCLC 組織中CEMIP 表達(dá)水平比正常肺上皮組織明顯上調(diào)，CEMIP 在研究隊(duì)列中的強(qiáng)陽性率達(dá)49.67%，且高表達(dá)CEMIP 與腫瘤低分化、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系[21]。本研究首先通過檢測(cè)收集的臨床標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)CEMIP 在NSCLC 癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肺泡組織，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用qPCR 及Western blotting 同樣證實(shí)了CEMIP 在NSCLC 細(xì)胞A549、H1299 中的表達(dá)顯著高于肺正常細(xì)胞BEAS-2B（P＜0.05）。進(jìn)一步通過干擾CEMIP 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，NSCLC 細(xì)胞的EMT 表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），而間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vi‐mentin、Twist1、Snail1 的表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），表明CEMIP參與調(diào)控NSCLC細(xì)胞的EMT表型轉(zhuǎn)變。

研究表明，NSCLC 細(xì)胞發(fā)生EMT 表型的變化主要受細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT、STAT3 信號(hào)通路的調(diào)控；抑制NSCLC 細(xì)胞中AKT[22]、STAT3[23]等信號(hào)通路，可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞EMT 轉(zhuǎn)化，降低NSCLC 的侵襲遷移能力。Luo等[22]人報(bào)道，在NSCLC細(xì)胞中使用PI3K抑制劑后，可顯著下調(diào)其下游AKT、p-AKT 以及mTOR、p-mTOR 的表達(dá)，進(jìn)而降低NSCLC 細(xì)胞的侵襲和遷移能力。p-AKT 能夠通過激活其下游mTOR 分子，或同時(shí)參與調(diào)控NSCLC 細(xì)胞EMT 轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)其侵襲遷移[24]。而AKT 的激活依賴于蛋白激酶Src 與AKT 的SH2 功能域結(jié)合，使AKT 位于473 位的絲氨酸磷酸化。本研究檢測(cè)到干擾CE‐MIP 后可引起Src 表達(dá)量的降低，且p-AKT 也相應(yīng)降低（P＜0.05），表明干擾CEMIP 能夠通過抑制Src表達(dá)，使其對(duì)信號(hào)蛋白AKT 的激活作用減弱。此外，還發(fā)現(xiàn)STAT3 也發(fā)生下調(diào)（P＜0.05），這可能與其上游p-AKT 表達(dá)降低有關(guān)，這一結(jié)果與Wei 等[25]發(fā)現(xiàn)抑制AKT/STAT3 能夠降低腎癌轉(zhuǎn)移的報(bào)道一致。

綜上所述，干擾CEMIP 表達(dá)可通過調(diào)控NSCLC 細(xì)胞中Src/AKT/STAT3 信號(hào)通路，抑制其EMT 過程，降低NSCLC 細(xì)胞侵襲、遷移能力。本研究提示CEMIP或可成為NSCLC 轉(zhuǎn)移治療的潛在靶點(diǎn)。