黃婉雪，楊 陽(yáng)，汪曉輝，賴永榕

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

地中海貧血(地貧) 是由于遺傳基因缺失或突變所致的慢性溶血性貧血。我國(guó)的廣西、廣東、海南、貴州、云南等省是地貧高發(fā)區(qū)[1]。正常情況下，成人的Hb 基本成分血紅蛋白A（HbA）由兩條α 珠蛋白與兩條β珠蛋白鏈組成。在β地貧中，由于β珠蛋白鏈合成減少或缺失，過(guò)量的α 珠蛋白鏈沉淀在紅細(xì)胞中，導(dǎo)致紅細(xì)胞機(jī)械和氧化損傷。臨床上表現(xiàn)為溶血性貧血、鐵過(guò)載及氧化應(yīng)激[2]。減少紅細(xì)胞中過(guò)量的α 珠蛋白鏈可以改善其過(guò)量帶來(lái)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)γ 珠蛋白生產(chǎn)可使其結(jié)合過(guò)多的α珠蛋白[3]，形成胎兒血紅蛋白（HbF），可以減輕β地貧的臨床癥狀[3-4]。最初，研究人員發(fā)現(xiàn)5-氮胞苷[5-6]、羥基脲[7]等藥物可以提升人體內(nèi)HbF 水平，但其毒副作用限制了臨床使用[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺能提升HbF 從而有效改善中間型或重型β地貧患者的貧血情況[9-11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可以減輕β 地貧輸血依賴患者的輸血量要求，提升非輸血依賴患者的血紅蛋白水平[9]。同時(shí)，可以減輕脾功能亢進(jìn)引起的血小板減少帶來(lái)的臨床癥狀[12]。賴永榕課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可以誘導(dǎo)正常成人體外培養(yǎng)的紅系細(xì)胞γ 珠蛋白的升高，轉(zhuǎn)錄因子BCL11A、KFL1 可能參與其中的調(diào)控[13]。然而，關(guān)于沙利度胺提升重型β 地貧患者紅系細(xì)胞γ珠蛋白的研究較少。本研究探索沙利度胺對(duì)體外培養(yǎng)的重型β 地中海貧血患者人紅系細(xì)胞γ珠蛋白基因（HBG）的誘導(dǎo)作用、患者紅系細(xì)胞分化及參與調(diào)控的BCL11A、KFL1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 CD34+磁珠(Miltenyi Biotec公司，批號(hào)：130-046-702)；羥基脲(Sigma 公司，批號(hào)：MKBR1926 V)；沙利度胺(TCI公司，批號(hào)：NQ4XL-PJ)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa 公司，批號(hào)：AI40713A)；FastStart Univernal SYBR Green Master(ROX) (Roche 公司，批號(hào)：31598800) ；Trizol 試劑(LIFE 公司，批號(hào)：162905)；RIPA 裂解液(碧云天，批號(hào)：P0013B)；PMSF(索萊寶，批號(hào)：20170614)；BSA[生工生物工程（上海）有限公司，批號(hào)：C500036]。無(wú)血清造血細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)基（SFEM；Stem Cell Technologies 公司，批號(hào)：18F91500）；干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（stem cell factor，SCF；peprotech 公司，批號(hào)：AF-300-07）；促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO；peprotech 公司，100-64）；白介素-3（IL-3；peprotech公司，AF-200-03）；5%人血清（Gemini 公司，貨號(hào)100-318）；CCK-8 試劑盒（beyotime,批號(hào)：C0038）；珠蛋白單克隆抗體(CST 公司，批號(hào):393865)；BCL11A 單克隆抗體(CST 公司，批號(hào)75432S)和GAPDH 單克隆抗體(CST 公司，批號(hào):2118S)；抗兔IgG 二抗(CST 公司，批號(hào):7074S)；HbF-PE (BD 公司；批號(hào):560041)；HbA-FITC (biorbyt 公司；批號(hào):orb15725)；CD71（PE-Mouse Anti-Human）(BD 公司批 號(hào):555537）；CD235a(FITC-Mouse Anti-Human)（BD公司，批號(hào):90249040）。

1.2 細(xì)胞收集與培養(yǎng) 細(xì)胞來(lái)源于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬血液內(nèi)科確診重型地中海貧血住院患者骨髓液。在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)及征得患者的知情同意后，采用骨髓穿刺術(shù)采集其骨髓液。使用CD34+磁珠分選單個(gè)核細(xì)胞懸液獲得的CD34+細(xì)胞。細(xì)胞通過(guò)兩相液體培養(yǎng)模型向紅系分化。在最初14 d(第一階段)，SFEM、SCF (50 ng/mL)、EPO (3 000 ng/mL)、IL-3(50 ng/mL)、1%雙抗、5%人血清培養(yǎng)；擴(kuò)大CD34+細(xì)胞數(shù)量。在接下來(lái)的7 d(第二階段)，EPO(3 000 ng/mL)、1%雙抗、5%人血清擴(kuò)增細(xì)胞并使其向紅系分化。沙利度胺溶解于DMSO。等量DMSO 溶劑為DMSO 組，100 μmol/L 羥基脲為陽(yáng)性對(duì)照組，100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L 沙利度胺為實(shí)驗(yàn)組。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)檢測(cè)γ 珠蛋白與參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平

檢測(cè)HBG、α 珠蛋白基因（HBA）、β 珠蛋白基因（HBB）及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子BCL11A、ATF4、HRI、KLF1、KLF2、GATA1、SOX6、TAL1表達(dá)。提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。HBG 及轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)錄水平在CFX96 TM Read Time System（BIO-ROD)PCR 儀器上進(jìn)行檢測(cè)。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算基因表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。引物均由上海擎科生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.4 蛋白免疫印跡法(Western blotting，WB)檢測(cè)γ珠蛋白與轉(zhuǎn)錄因子BCL11A翻譯水平 收集處理不同分化時(shí)間的后各組細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白。BCA 法進(jìn)行蛋白定量，分別取20 pg 總蛋白上樣，濕法轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%的BSA 封閉，一抗γ 珠蛋白、BCL11A、GAPDH（1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，加入抗兔IgG 二抗（1∶1 000）。使用ECL 顯色，X 線膠片曝光后，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。GAPDH為內(nèi)參標(biāo)記抗體。

1.5 流式細(xì)胞術(shù) 選取最適濃度與檢測(cè)紅系分化免疫熒光染色：PBS 洗滌3 遍，2%多聚甲醛固定，使用破膜劑增加細(xì)胞膜透性，HbF-PE 和HbA-FITC 流式抗體染色。細(xì)胞的表型特征檢測(cè)：利用流式細(xì)胞儀分析紅細(xì)胞在不同分化時(shí)期細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。使用CD71-PE；CD235a-FITC 標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染色(30 min)，采用BD 公司和FlowJo流式細(xì)胞儀軟件進(jìn)行分析。

表1 引物序列

1.6 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 將不同濃度沙利度胺作用不同時(shí)間的細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞/孔密度接種到96 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)副孔。將10 μL CCK-8 溶液添加至每孔中。37 ℃孵育4 h 后，在酶標(biāo)儀中選擇450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沙利度胺誘導(dǎo)重型β 地中海貧血患者紅系γ珠蛋白提升的最適濃度與時(shí)間 利用CCK8檢測(cè)不同藥物濃度與作用時(shí)間對(duì)于重型β地貧患者紅系細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的情況（圖1A）。結(jié)果顯示，200 μmol/L沙利度胺作用72 h 時(shí)抑制率達(dá)56.92%。利用qPCR檢測(cè)不同藥物濃度與作用時(shí)間對(duì)HBG mRNA 表達(dá)的影響（圖1B）。200 μmol/L、300 μmol/L 沙利度胺作用72 h 后，γ 珠蛋白轉(zhuǎn)錄水平比DMSO 組升高2倍（P＜0.05），與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度作用72 h 下，HbA 與HbF 的表達(dá)（圖1C～圖1E）。流式結(jié)果顯示，在200 μmol/L 沙利度胺作用72 h后，HbF 較DMSO 組明顯升高。根據(jù)結(jié)果選擇200 μmol/L沙利度胺作用72 h為最適條件。

2.2 沙利度胺對(duì)重型β 地貧患者紅系的珠蛋白表達(dá)的影響 在200 μmol/L 沙利度胺作用重型β 地貧患者紅系72 h 下，采用qPCR 檢測(cè)HBG mRNA 在不同分化時(shí)間段表達(dá)情況（圖2A）。HBG mRNA 在分化第7天開(kāi)始升高，在紅系細(xì)胞分化第14天表達(dá)量高于對(duì)照組3 倍（P＜0.05）。相同作用時(shí)間和濃度下，沙利度胺對(duì)于HBA 與HBB 在分化過(guò)程中的表達(dá)無(wú)明顯影響(P＞0.05，圖2B～圖2C）。最后，利用WB 檢測(cè)重型β 地貧患者紅系γ 珠蛋白在分化階段的表達(dá)情況（圖2D），200 μmol/L 沙利度胺組γ 珠蛋白在分化第14 天高表達(dá)，與qPCR 結(jié)果顯示一致。結(jié)果顯示，沙利度胺可以在分化中不影響紅系HBA、HBB 轉(zhuǎn)錄水平的情況下，提升γ 珠蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，并且在分化第14天時(shí)提升最明顯。

2.3 沙利度胺對(duì)重型β 地中海貧血患者紅系分化的影響 200 μmol/L 沙利度胺作用β 地貧患者紅系72 h 后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD71、CD235a 在各個(gè)分化時(shí)間段表達(dá)（圖3A～圖3C）。隨著分化時(shí)間的增加，兩組紅系表面分化標(biāo)記物CD71、CD235a 逐漸增高。但200 μmol/L 沙利度胺組紅系表面分化標(biāo)記物較DMSO 組在分化后期有所降低（P＜0.05），提示沙利度胺對(duì)紅系分化產(chǎn)生抑制效果。

2.4 參與重型β 地中海貧血患者紅系γ 珠蛋白與分化調(diào)控基因的表達(dá)情況 200 μmol/L沙利度胺作用β 地貧患者紅系72 h 后，利用WB 檢測(cè)BCL11A的表達(dá)情況。200 μmol/L 沙利度胺組BCL11A 的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平較DMSO 組減少（P＜0.05，圖4A～圖4B）。利用qPCR 檢測(cè)β 地貧患者參與紅系調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子在不同分化時(shí)間段的表達(dá)（圖4C～圖4I），結(jié)果顯示，與DMSO 組相比，200 μmol/L 沙利度胺組ATF4 在分化第21 天表達(dá)下降（P＜0.05）；HRI 在分化第14、第21 天表達(dá)下降（P＜0.05）；KLF1 在分化第7、第21 天表達(dá)下降（P＜0.05）；KLF2 在分化中的表達(dá)與DMSO 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；GATA1 表達(dá)量在分化第7、第21 天下降（P＜0.05）；SOX6 在分化第14、第21 天表達(dá)下降（P＜0.05）；TAL1在分化第21天表達(dá)下降（P＜0.05）。使用沙利度胺后，紅系細(xì)胞內(nèi)BCL11A 下降，同時(shí)HRI、ATF4 均為下降趨勢(shì)，提示沙利度胺可能通過(guò)HRI、ATF4 通 路 下 調(diào)BCL11A。KLF1、GATA1、SOX6、TAL1 的下調(diào)變化可能在沙利度胺提升紅系細(xì)胞內(nèi)γ珠蛋白的過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖1 藥物濃度與作用時(shí)間對(duì)于提升β地中海貧血患者紅系γ珠蛋白的比較

圖2 沙利度胺對(duì)于β地中海貧血患者紅系的γ珠蛋白的影響

圖3 沙利度胺對(duì)β地中海貧血患者紅系分化的影響

圖4 參與調(diào)控β地中海貧血患者紅系γ珠蛋白的轉(zhuǎn)錄因子基因在分化過(guò)程中的表達(dá)情況

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可以在不影響α 珠蛋白與β 珠蛋白的轉(zhuǎn)錄水平下，提升體外培養(yǎng)的重型β地貧紅系細(xì)胞內(nèi)γ 珠蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。與DMSO 組相比，γ 珠蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平隨著分化時(shí)間推移而增加且在第14天達(dá)到最高。其次，在沙利度胺的作用下，紅系細(xì)胞的表面分化標(biāo)記物表達(dá)較對(duì)照組下降（P＜0.05），提示沙利度胺影響了紅系分化。另外，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)錄因子BCL11A的表達(dá)在分化第7 天降低；KLF1、GATA1 在分化第7、第21 天表達(dá)下降；HRI、SOX6 在分化第14、第21 天表達(dá)下降；ATF4、TAL1 在分化第21 天表達(dá)下降（P＜0.05）。上述轉(zhuǎn)錄因子可能在沙利度胺提升重型β地貧紅系細(xì)胞內(nèi)γ珠蛋白的過(guò)程中發(fā)揮作用。

CD71 為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，在紅系分化早期高表達(dá)[14]。CD235a 為紅系成熟表面標(biāo)記物[15]，隨著紅系的成熟而表達(dá)增加。在分化過(guò)程中，沙利度胺組CD235a較DMSO組降低（P＜0.05）。提示沙利度胺可能通過(guò)減緩體外培養(yǎng)的重型β地貧紅系細(xì)胞的分化和成熟。研究表明，HRI 可以通過(guò)ATF4 調(diào)控BCL11A[16]。本研究中，HRI、ATF4 在分化過(guò)程中表達(dá)降低，提示沙利度胺可能通過(guò)HRI、ATF4 通路下調(diào)BCL11A。又有研究表明，在珠蛋白基因簇轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，KLF1、GATA1 參與抑制γ 珠蛋白表達(dá)的過(guò)程[17]；KLF1 與GATA1 在分化第7、第21 天下調(diào)可能與其參與沙利度胺誘導(dǎo)紅系HBG 表達(dá)的過(guò)程有關(guān)。SOX6 與TAL1 不僅可以抑制γ 珠蛋白的表達(dá)，同時(shí)在紅系分化中參與紅系增殖與成熟，調(diào)控分化[18-19]；在本實(shí)驗(yàn)中SOX6 與TAL1 在分化末期第21天均下降，SOX6與TAL1可能也參與沙利度胺誘導(dǎo)紅系HBG表達(dá)、影響紅系分化過(guò)程。

目前，一些研究已注意到沙利度胺能提升重型β地貧患者體內(nèi)γ珠蛋白[20-21]。但少有研究探索沙利度胺提升γ珠蛋白涉及的機(jī)制。本研究采用二階段培養(yǎng)體系體外培養(yǎng)重型β 地貧患者紅系細(xì)胞，此體系模擬體內(nèi)環(huán)境，結(jié)果更具可靠性。結(jié)果證實(shí)了沙利度胺能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)重型β 地貧患者紅系細(xì)胞γ珠蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯水平升高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可能通過(guò)減緩紅系細(xì)胞的分化成熟，增加未成熟紅細(xì)胞的增殖，從而有效誘導(dǎo)HbF 產(chǎn)生。在誘導(dǎo)過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子BCLl1A、KLF1、GATA1 的下調(diào)可能是沙利度胺誘導(dǎo)HBG表達(dá)的作用機(jī)制之一；并且沙利度胺有可能在分化末期通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子SOX6與TAL1，從而減緩紅系的分化，調(diào)節(jié)珠蛋白轉(zhuǎn)錄，從而有效誘導(dǎo)γ珠蛋白。