高靜貴，徐 琛，秦振秀，瞿 祥，吳 雙，梁程偉，謝曉云，劉競麗

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧 530021）

缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，其特征是大腦區(qū)域的血液循環(huán)突然中斷。目前，通過靜脈溶栓治療或介入手術(shù)取栓治療快速恢復(fù)血液供應(yīng)已成為缺血性腦卒中最有效治療方法。但是，這會導(dǎo)致腦缺血/再灌注（I/R）損傷增加，加劇缺血后進一步的腦損傷和功能障礙。因此，闡明腦I/R 損傷潛在的分子機制，有助于改善腦I/R 損傷后的功能恢復(fù)。

眾所周知，miRNA 是轉(zhuǎn)錄后負向調(diào)控基因表達的關(guān)鍵介質(zhì)，可以通過結(jié)合靶mRNA的3'-UTR區(qū)來調(diào)節(jié)多種生物過程[1]。隨著I/R研究的深入，對miR‐NA 在腦I/R 損傷中的作用的研究逐漸增多。例如敲低miR-34a 可以通過激活Notch1/HIF-1α 信號通路減輕大鼠腦組織損傷和神經(jīng)元凋亡[2]。MiR-21通過靶向MAP2K3 來預(yù)防血腦屏障的破壞，從而發(fā)揮腦I/R 損傷中的神經(jīng)保護作用[3]。相反，miR-27b 通過調(diào)節(jié)AMP 激活的蛋白激酶活性來促進缺血性卒中的恢復(fù)[4]。上述實驗均明確表明，miRNA 在腦I/R損傷過程中起著重要作用。Norcini 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b-3p 可阻止大鼠周圍神經(jīng)損傷后持續(xù)性冷和機械性異位疼痛的發(fā)展。然而，miR-133b-3p 在腦I/R損傷的機制尚不完全清楚。

越來越多的證據(jù)表明，包括miR-133b-3p 在內(nèi)的miRNA 的表達水平會隨著神經(jīng)損傷的變化而發(fā)生變化，這表明它們可能會影響腦損傷的病理生理過程[6]。為了分析miR-133b-3p 對I/R 后神經(jīng)功能的潛在影響，本研究采用了I/R 模型，并通過腦室內(nèi)注射miR-133b-3p 激動劑和抑制劑來觀察對神經(jīng)功能和腦組織的影響，并研究其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 腦立體定位儀、大鼠MCAO線栓（型號：MSRC37B250PK50）、動物麻醉機和異氟烷購自深圳瑞沃德公司；Trizol 購自美國Life 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR（qPCR）檢測試劑盒購自日本TaKaLa 公司；大鼠miR-133b-3p 引物購自廣州復(fù)能公司；miR-133b-3p激動劑（agomir）和miR-133b-3p 抑制劑（antagomir）及其陰性對照物（NC）由廣州銳博生物公司提供。

1.2 實驗動物及分組 SPF 級雄性SD 大鼠36 只，體重250～280 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK 桂2020-0003，動物使用合格證號：SYXK 桂2020-0004。動物飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度50%，光照條件為12 h 明/12 h 暗。本研究動物實驗及處置符合廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心動物實驗倫理要求。

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為6 組，分別為假手術(shù)組、I/R 組、I/R+agomir 組、I/R+antagomir組、I/R+agomir NC 組、I/R+antagomir NC 組，每組6只。

1.3 大腦中動脈I/R 損傷大鼠模型的建立 大鼠術(shù)前12 h 禁食，自由飲水。采用異氟烷吸入麻醉大鼠，頸部、頭部備皮、消毒。剪開頭部皮膚，取大鼠頭部正中切口，以前囟為原點，應(yīng)用腦立體定位儀進行定位（坐標(biāo)：X=0.8 mm，Y=1.1 mm，Z=3 mm），用手持式微型電鉆開一小孔，將miR-133b-3p agomir、miR-133b-3p antagomir 及其NC 注入各組大鼠右側(cè)腦室，24 h后采用線栓法制備大鼠大腦中動脈I/R損傷模型。分離頸總動脈，頸內(nèi)、頸外動脈，在右側(cè)頸總動脈切一小口，將線栓經(jīng)頸總動脈通過頸內(nèi)動脈插入至大腦中動脈，閉塞大腦中動脈造成腦缺血，2 h后拔出線栓恢復(fù)血流，再灌注24 h。假手術(shù)組僅分離頸總動脈，未插入線栓。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評分 再灌注24 h 后采用Longa評分法[7]對各組大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評分。神經(jīng)學(xué)檢查分為5個等級，0分：正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：對側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2 分：行走時，大鼠向?qū)?cè)（癱瘓側(cè)）轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3 分：行走時，大鼠身體向癱瘓側(cè)傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，有意識喪失。

1.5 qPCR 法檢測大鼠miR-133b-3p 表達 I/R 24 h后斷頭取大鼠腦組織，使用TRizol 提取腦組織的總RNA，然后使用氯仿和異丙醇進行分離。使用Na‐no Drop 2000 測量總RNA 的濃度和純度。大鼠miR-133b-3p 的引物序列為上游：5’-CTTTGGTCCCCTTCAACCAGCTA-3’，下游：5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR。使用Applied Biosystems 7500儀器進行PCR擴增反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃退火5 s，60 ℃延伸34 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算miRNA 相對表達水平。

1.6 大鼠腦組織病理檢查 取腦組織，石蠟包埋，切片，梯度酒精中脫水，蘇木精染色5 min，伊紅染色3 min，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察大鼠腦組織病理形態(tài)變化。

1.7 原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測神經(jīng)元細胞凋亡 按照One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit試劑盒（Roche 公司）說明書進行操作。制備腦組織切片，60 ℃烘烤1 h，二甲苯中脫蠟并用梯度酒精脫水，室溫下用蛋白酶K 處理20 min，加入TUNEL 反應(yīng)工作溶液，37 ℃下孵育1 h，PBS清洗，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察TUNEL 染色結(jié)果并拍照。計算神經(jīng)元細胞凋亡率，神經(jīng)元細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)量/總細胞數(shù)量×100%。

1.8 miR-133b-3p 的靶基因分析 使用DIANA 數(shù)據(jù)庫（融合了TarBase、microT-CDS和targetscan數(shù)據(jù)集）預(yù)測了miR-133b-3p 的靶基因[8]，并進行了下游通路分析[9]，同時分析靶基因上游相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和激酶，并進行相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建[10]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評分與假手術(shù)組比較，I/R 組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯升高（P＜0.01）；與相應(yīng)NC組比較，I/R+agomir 組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯升高（P＜0.01），而I/R+antagomir 組神經(jīng)行為學(xué)評分顯著降低（P＜0.05），見圖1。

2.2 miR-133b-3p 表達水平 與假手術(shù)組比較，I/R組miR-133b-3p 表達水平明顯下降（P＜0.05）；與I/R+agomir NC 組比較，I/R+agomir 組miR-133b-3p 表達量明顯升高（P＜0.01），與I/R+antagomir NC 組比較，I/R+antagomir 組miR-133b-3p 表達量顯著降低（P＜0.01），見圖2。

2.3 蘇木精－伊紅（HE）染色結(jié)果 假手術(shù)組中，神經(jīng)元細胞核大而圓，染色淺，核仁明顯，而I/R 組中神經(jīng)元出現(xiàn)萎縮，核深染和空泡現(xiàn)象（黃色箭頭所示）；與I/R+agomir NC組比較，I/R+agomir組可見大部分神經(jīng)元萎縮（綠色箭頭所示），神經(jīng)元深染并出現(xiàn)明顯的液泡變化，細胞間隙增大；相反，I/R+an‐tagomir組與其NC組比較，神經(jīng)元損傷明顯減少，神經(jīng)元核染清晰可辨，見圖3。

2.4 TUNEL 染色結(jié)果 與I/R 組比較，I/R+agomir組TUNEL 陽性細胞（紅色熒光）數(shù)顯著增加，I/R+antagomir可以顯著逆轉(zhuǎn)大鼠腦I/R 損傷引起的神經(jīng)元凋亡，與I/R+antagomir NC 組比較，I/R+antagomir組細胞凋亡率明顯降低（均P＜0.01），見圖4、圖5。

圖1 miR-133b-3p對大腦中動脈I/R損傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的影響

圖2 大鼠miR-133b-3p相對表達量

圖3 大鼠腦組織切片HE染色(×200)

圖4 大鼠腦組織切片TUNEL染色（×200）

圖5 6組大鼠神經(jīng)元細胞凋亡率比較

2.5 KEGG 通路富集分析 為了進一步了解靶基因的生物學(xué)作用，使用webgestalt 數(shù)據(jù)庫進行靶基因通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通路主要富集于自噬、加壓素水吸收的調(diào)節(jié)及MAPK信號通路等，見表1。

表1 靶基因生物學(xué)通路分析

2.6 上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析 使用X2K 軟件揭示miR-133b-3p 靶基因富集的前20 個轉(zhuǎn)錄因子和激酶，其中UBTF 和MAPK 為得分最高的轉(zhuǎn)錄因子和激酶。對這些靶基因、轉(zhuǎn)錄因子及激酶進行上游調(diào)控相互作用分析，通過eXpression2Kinases（X2K）算法將富集的轉(zhuǎn)錄因子－基因－激酶相連接，逐步構(gòu)建完整的上游轉(zhuǎn)錄因子—基因—激酶交互網(wǎng)絡(luò)，見圖6。

圖6 上游轉(zhuǎn)錄因子—靶基因—激酶交互網(wǎng)絡(luò)

3 討論

腦I/R 損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，受多種因素調(diào)節(jié)。當(dāng)前miRNA已被證明在腦I/R損傷所致的神經(jīng)元死亡中起重要的調(diào)節(jié)作用，從而影響疾病的發(fā)生和發(fā)展進程[11]。目前miR-133 主要在心肌梗死方面研究較多，如miR-133 抑制ROS 生成和抑制caspase-3 凋亡信號通路來預(yù)防心肌梗死[14-15]，在腦I/R 損傷方面鮮有報道，值得進一步研究。本研究首次提供證據(jù)表明抑制miR-133-3p 表達在I/R 大鼠模型中發(fā)揮了神經(jīng)保護作用。

研究表明，miR-133 可以通過靶向LASP1 來抑制細胞增殖并促進凋亡[16]。同時，抑制miR-133b-3p的表達可保護神經(jīng)元細胞免受多巴胺誘導(dǎo)的死亡[17]。miR-133b 表達下調(diào)可抑制巨噬細胞的免疫反應(yīng)，并通過MAML1 介導(dǎo)的Notch 信號通路減弱血管損傷[18]。本研究結(jié)果表明，miR-133b-pagomir能明顯提高大腦中動脈I/R 損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分，加重大鼠神經(jīng)元損傷，而注射miR-133-3p an‐tagomir 后，大鼠的行為學(xué)評分發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，神經(jīng)元凋亡數(shù)減少（P＜0.05）。說明抑制miR-133b-3p的表達可以起到保護大腦I/R 損傷的作用。miR-133b 是腦I/R 損傷的新型治療靶點。HE 染色結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，I/R 組HE 染色核固縮深染，形狀不規(guī)則，結(jié)構(gòu)不清，核周胞質(zhì)不明顯；在注射miR-133-3p antagomir 的I/R 大鼠腦組織中，神經(jīng)元核染清晰可辨，均勻分布，異染色質(zhì)少。本研究HE 染色和TUNEL染色結(jié)果均表明，miR-133-3p下調(diào)可有效抑制大腦中動脈I/R大鼠的神經(jīng)元損傷。

目前miRNA 的研究越來越多，但缺乏完整的miRNA 生物學(xué)功能和上、下游信號途徑的分析。為了闡明miR-133-3p 可能涉及的上、下游機制，本研究使用生物信息學(xué)目標(biāo)預(yù)測工具將UBTF和MAPK分別鑒定為miR-133-3p 的上游轉(zhuǎn)錄因子和激酶目標(biāo)。轉(zhuǎn)錄因子和激酶可作為miRNA 和靶基因的重要調(diào)控因子，以不同方式參與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育和功能調(diào)節(jié)[19]。UBTF 可以使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)固縮，從而導(dǎo)致神經(jīng)元變性[20]，同時UBTF 也可阻止細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡[21]。MAPK 是細胞內(nèi)激酶，將細胞外環(huán)境的信號轉(zhuǎn)化為精確的細胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)，并在細胞間同步調(diào)節(jié)各種生理過程，如細胞生長、分化、衰老和凋亡等功能[22]。同時，miR-133-3p 靶基因富集于自噬和MAPK 通路。以往的研究表明，自噬和MAPK 信號通路參與了卒中后細胞因子表達和細胞凋亡的調(diào)節(jié)，影響突觸傳遞、神經(jīng)元重塑等生物學(xué)過程[23-25]。在I/R 模型中，抑制MAPK 的激活可減少同側(cè)皮質(zhì)的氧化應(yīng)激和凋亡，從而促進神經(jīng)元存活和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放，改善神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化。筆者推測，抑制miR-133-3p 表達可能通過抑制自噬和MAPK 通路的激活來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，miR-133-3p 在大腦中動脈I/R 大鼠中低表達，抑制miR-133-3p 表達可保護腦免受I/R損傷，但是miR-133-3p 影響靶基因上游的轉(zhuǎn)錄因子和激酶及下游的信號通路仍需進一步研究。