楊明乾，陳雪萍，劉會(huì)長(zhǎng)，熊 浪

（湖北省鄂州市中心醫(yī)院 1.麻醉科；2.重癥醫(yī)學(xué)科，鄂州 436000）

肺缺血再灌注損傷（lung ischemic reperfusion injury，LIRI）是臨床上的常見(jiàn)疾病，如心肺復(fù)蘇、肺移植、單肺通氣、體外循環(huán)和肺栓塞等[1]。LIRI 是一種發(fā)病率和病死率均較高的急性無(wú)菌性肺損傷，其發(fā)病機(jī)制包括氧化應(yīng)激損傷、鈣超載、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷、炎性損傷、自噬和凋亡等[2-4]。氯胺酮是一種常用的靜脈麻醉劑，可擴(kuò)張支氣管，并抑制促炎細(xì)胞因子分泌，發(fā)揮抗炎作用[5]。有研究表明，氯胺酮預(yù)處理對(duì)肝臟缺血再灌注引起的急性肺損傷有明顯的保護(hù)作用，可能是由核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）途徑介導(dǎo)的[6]。NF-κB 是絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine protein kinase，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapa‐mycin，mTOR）下游關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。Wen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Akt/mTOR 信號(hào)通路的活化能夠減輕肢體缺血再灌注所致的急性肺損傷。本研究通過(guò)復(fù)制大鼠LIRI 模型，觀察氯胺酮對(duì)LIRI 的影響，并通過(guò)檢測(cè)Akt/mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，探討氯胺酮對(duì)大鼠LIRI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠，體重230～250 g，購(gòu)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2018-0023。所有動(dòng)物在安靜清潔的環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（55±15）%，12 h明暗交替，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循“3R”原則。

1.2 藥物和主要試劑

氯胺酮，貨號(hào)：N-036，購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；白細(xì) 胞 介 素（interleukin，IL）-6 試 劑 盒（貨 號(hào)：ab178013）、IL-1β 試劑盒（貨號(hào)：ab197742）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）試劑盒（貨號(hào)：ab181421）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號(hào)：A003-1-2）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（貨號(hào)：A044-1-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dis‐mutase，SOD）試劑盒（貨號(hào)：A001-3-2）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（貨號(hào)：A007-1-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蘇木精－伊紅（HE）染色試劑盒（貨號(hào)：C0105）、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C1091）購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；一抗磷酸化（phosphorylated，p-）Akt（貨號(hào)：4060）、pmTOR（貨號(hào)：5536）、p-NF-κB p65（貨號(hào)：8242）、內(nèi)參β-actin（貨號(hào)：58169）及二抗（貨號(hào)：7076）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自加拿大Mexico公司，光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 公司，酶標(biāo)儀、蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；凝膠成像儀購(gòu)自杭州Miulab公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠LIRI模型的制備 按照文獻(xiàn)[8]的方法，首先用1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，待充分麻醉后，靜脈注射生理鹽水（10 mL/kg/h），行氣管插管，連接到小動(dòng)物呼吸機(jī)上進(jìn)行機(jī)械通氣，調(diào)整參數(shù)：呼吸頻率60 次/min，潮氣量1.5 mL/kg，呼吸比（I∶E）1∶2.5，吸入氧濃度（FiO2）99%；在大鼠第四肋間打開(kāi)胸腔，鈍性分離皮下組織，在呼氣期暴露并切開(kāi)胸膜，暴露左側(cè)胸腔，仔細(xì)分離左側(cè)肺門，顯露氣管；經(jīng)尾靜脈注入300 U/kg 肝素，10 min 后，用無(wú)創(chuàng)性血管夾夾閉左肺門建立缺血模型，60 min 后松開(kāi)血管夾，恢復(fù)左肺通氣與供血120 min。

1.4.2 動(dòng)物分組 將60只SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、氯胺酮低劑量組、氯胺酮中劑量組和氯胺酮高劑量組，每組12 只。假手術(shù)組僅開(kāi)胸，不夾閉左肺門。其他4 組建立LIRI 大鼠模型。氯胺酮低、中、高劑量組大鼠于阻斷左肺門靜脈前，分別于尾靜脈注射2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg 的氯胺酮[9]。

1.4.3 血清炎性因子含量檢測(cè) 再灌注120 min后，各組大鼠心臟取血，離心，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.4.4 大鼠肺組織濕重/干重（W/D）比值 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉下處死大鼠，取出完整左肺組織，稱濕重，再置于80 ℃干燥箱中烘烤24 h，稱干重，計(jì)算肺組織W/D。

1.4.5 肺組織病理變化 取左肺組織，置于甲醛中固定24 h，脫水透明，浸蠟包埋，切片，行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)變化。

1.4.6 肺組織MDA含量和SOD、CAT、MPO活性測(cè)定 取左肺組織，制成組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)肺組織中MDA 含量和SOD、CAT、MPO 活性。

1.4.7 肺組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL 法對(duì)肺組織的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，每只大鼠隨機(jī)選擇5張切片，每張切片選擇5個(gè)具有代表性的高倍鏡視野（×400），記錄TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞）數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.8 肺組織p-Akt、p-mTOR、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)測(cè)定 提取肺組織總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白含量，SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，一抗（p-Akt、pmTOR、p-NF-κB p65，稀釋倍數(shù)為1∶500）4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，洗膜后孵二抗（稀釋倍數(shù)為1∶1 000），室溫下孵育2 h，ECL 顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，Im‐age J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮對(duì)LIRI大鼠肺組織W/D的影響

與假手術(shù)組（3.64±0.38）比較，模型組大鼠（6.49±0.51）肺組織W/D 比值顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，氯胺酮各劑量組[（5.31±0.34）、（4.19±0.29）、（3.75±0.31）]肺組織W/D 比值顯著降低（P＜0.05）。

2.2 氯胺酮對(duì)LIRI大鼠血清炎性因子含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，氯胺酮各劑量組血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠血清炎性因子含量比較 pg/mL，±s

表1 5組大鼠血清炎性因子含量比較 pg/mL，±s

與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與氯胺酮低劑量組比較，cP＜0.05；與氯胺酮中劑量組比較，dP＜0.05。

2.3 氯胺酮對(duì)LIRI大鼠肺組織MDA 含量和MPO、SOD、CAT活性的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織MDA 含量、MPO 活性顯著升高（P＜0.05），SOD、CAT 活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，氯胺酮各劑量組肺組織MDA 含量、MPO 活性顯著降低（P＜0.05），SOD、CAT 活性顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見(jiàn)表2。

2.4 氯胺酮對(duì)LIRI大鼠肺組織病理變化的影響

假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，無(wú)明顯充血、水腫及炎性浸潤(rùn)；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，肺間質(zhì)充血水腫，肺間隔變厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出；氯胺酮各劑量組大鼠肺組織損傷程度明顯減輕，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

2.5 氯胺酮對(duì)LIRI大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率的影響

與假手術(shù)組[（3.18±1.15）%]比較，模型組[（39.67±5.49）%]大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組[（39.67±5.49）%]比較，氯胺酮低劑量組[（31.53±4.25）% ]、氯胺酮中劑量組[（23.92±3.68）%]、氯胺酮高劑量組[（11.38±2.32）%]肺組織細(xì)胞凋亡率顯著降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.6 氯胺酮對(duì)LIRI 大鼠肺組織p-Akt、p-mTOR、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

表2 5組大鼠肺組織MDA含量和MPO、SOD和CAT活性比較 ±s

表2 5組大鼠肺組織MDA含量和MPO、SOD和CAT活性比較 ±s

與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與氯胺酮低劑量組比較，cP＜0.05；與氯胺酮中劑量組比較，dP＜0.05。

圖1 大鼠肺組織HE染色圖（×100）

圖2 大鼠肺組織TUNEL染色圖（×100）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織p-Akt、pmTOR 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），p-NF-κB p65蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，氯胺酮各劑量組肺組織p-Akt、p-mTOR 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），p-NF-κB p65 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表3。

圖3 大鼠肺組織蛋白電泳圖

表3 5 組大鼠肺組織p-Akt、p-mTOR、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較±s

表3 5 組大鼠肺組織p-Akt、p-mTOR、p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較±s

與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與氯胺酮低劑量組比較，cP＜0.05；與氯胺酮中劑量組比較，dP＜0.05。

3 討論

LIRI 是缺血組織器官血流恢復(fù)后，組織損傷加重，甚至不可逆轉(zhuǎn)的病理現(xiàn)象[10]。主要特征是微血管通透性增加、肺血管阻力增加、肺水腫和氧合功能受損，可由創(chuàng)傷、肺栓塞、肺血栓形成或外科手術(shù)（如肺移植或體外循環(huán)心胸手術(shù)）引起[11]。本研究通過(guò)無(wú)創(chuàng)性血管鉗夾法建立大鼠LIRI 模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIRI 模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，肺間質(zhì)充血水腫，肺間隔變厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和紅細(xì)胞滲出，血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量及肺組織W/D、細(xì)胞凋亡率、MDA 含量、MPO 活性顯著升高，SOD、CAT 活性顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明LIRI 大鼠肺組織損傷嚴(yán)重，且伴隨嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，揭示模型構(gòu)建成功。

大量的研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮對(duì)肺組織具有明顯的保護(hù)作用。氯胺酮可通過(guò)抑制HMGB1-RAGE水平減輕脂多糖引起的肺損傷[12]。在研究機(jī)械通氣引起的急性肺損傷患者后發(fā)現(xiàn)，氯胺酮可明顯改善患者的血?dú)夂头喂δ苤笖?shù)[13]。LIRI 大鼠經(jīng)氯胺酮處理后，大鼠肺組織損傷程度明顯減輕，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織W/D 比值、細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明氯胺酮可減輕LIRI 大鼠肺損傷程度，減輕肺組織病理變化。大劑量的氯胺酮通過(guò)抑制組織中TNF-α、IL-6 的表達(dá)降低急性肺損傷程度[14]。本研究中，氯胺酮各劑量組血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05），結(jié)果與其一致，說(shuō)明氯胺酮可顯著抑制炎性因子的表達(dá)，減輕肺組織損傷。肺中性粒細(xì)胞（pulmonary polymorphonu‐clear neutrophil，PMN）聚集是LIRI 炎癥反應(yīng)的罪魁禍?zhǔn)譡15]。MPO 是中性粒細(xì)胞中唯一存在的還原酶，其活性可以用來(lái)反映PMN 積聚的程度[16]。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，而SOD和CAT是細(xì)胞內(nèi)的一種關(guān)鍵抗氧化酶。在氯胺酮處理后，肺組織MDA 含量、MPO 活性顯著降低，SOD、CAT 活性顯著升高（P＜0.05），表明氯胺酮可減少LIRI 大鼠肺組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)肺組織功能。

PI3K/Akt 通路可參與響應(yīng)細(xì)胞外信號(hào)刺激生存和生長(zhǎng)，通路的激活對(duì)于產(chǎn)生炎癥介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞外信號(hào)的反應(yīng)非常重要[17]。mTOR 為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以感知和整合各種環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)刺激，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞壓力和能量水平。NF-κB調(diào)節(jié)先天和獲得性免疫反應(yīng)以及炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[18]。mTOR 和NF-κB 都是Akt 的下游關(guān)鍵效應(yīng)因子。適當(dāng)抑制PI3K/Akt/mTOR 將激活NFκB，釋放隨后的炎性介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子[19]。有研究指出可通過(guò)Akt/mTOR/NF-κB 途徑抑制炎癥[20]。在大鼠LIRI 模型中發(fā)現(xiàn)，肺組織p-Akt、p-mTOR 蛋白水平顯著降低，p-NF-κB p65 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明Akt/mTOR信號(hào)通路與LIRI大鼠炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。右美托咪定治療可以通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上激活PI3K/Akt 信號(hào)通路來(lái)減輕肺缺血再灌注損傷[8]。LIRI 大鼠在氯胺酮藥效作用下，肺組織p-Akt、p-mTOR 蛋白水平顯著升高，p-NF-κB p65蛋白水平顯著降低（P＜0.05），表明氯胺酮可激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，減輕肺組織的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，氯胺酮可能通過(guò)激活A(yù)kt/mTOR 信號(hào)通路，減少炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕肺組織病理變化，保護(hù)LIRI 大鼠肺功能。然而，LIRI 的病理過(guò)程比較復(fù)雜，氯胺酮對(duì)肺組織的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。