楊少兵，胡柳，遲曉慧，張志發(fā)

神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)受損導(dǎo)致的慢性或持續(xù)性疼痛，其主要特征是自發(fā)痛、痛覺過(guò)敏、觸誘發(fā)通和感覺異常，并在神經(jīng)損傷后持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前關(guān)于神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制尚未明了，且對(duì)其治療也存在很多缺陷。深入探索疼痛的發(fā)病機(jī)制，尋找疼痛治療靶點(diǎn)，對(duì)提高疼痛治療效果有著深遠(yuǎn)的意義。

最近研究表明血神經(jīng)屏障（blood nerve barrier，BNB）參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展[1]。BNB主要由神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜組成，正常情況下能夠維護(hù)神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，保護(hù)神經(jīng)纖維。但在某些病理狀態(tài)下（如坐骨神經(jīng)受損后），BNB通透性增加，屏障功能減弱[2]，外周的纖維蛋白原及炎性因子穿過(guò)通透性增加的BNB，作用于外周神經(jīng)導(dǎo)致痛閾值降低，參與慢性疼痛的病理過(guò)程[3]。但BNB在疼痛中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。緊密連接是BNB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)之一，密封蛋白（Claudin）-1是緊密連接蛋白中最重要的一種，Claudin-1表達(dá)下降導(dǎo)致BNB通透性增加[4]，可能是慢性疼痛發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究擬制備慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷（chronic constriction injury of sciatic nerve，CCI）模型大鼠，觀察Claudin-1和BNB通透性的變化，探討其在慢性神經(jīng)性疼痛中的具體作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

清潔級(jí)雌性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。伊文斯藍(lán)（Evans blue，EB）購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；兔抗Claudin-1單克隆抗體購(gòu)自德國(guó)Life Technologies公司（貨號(hào)51-9000），β-actin抗體購(gòu)自Sigma Aldrich公司（貨號(hào)#A3854），Lumi-Light熒光試劑盒和DAPI均購(gòu)自德國(guó)Roche公司。逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）引 物 購(gòu) 自 德 國(guó)MWG Eurofins公司。

1.2 方法

1.2.1 分組所有大鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組（Control組），假手術(shù)組（Sham組）和慢性疼痛組（CCI組），各組6只。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，每組大鼠各時(shí)間點(diǎn)均提取6樣標(biāo)本進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。對(duì)照組不做處理；另外2組大鼠經(jīng)10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定，分離暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)，Sham組僅暴露不結(jié)扎，CCI組用4/0絲線在坐骨神經(jīng)上打4個(gè)松結(jié)，每個(gè)結(jié)間隔1 mm，結(jié)扎強(qiáng)度以引起小腿肌肉輕度顫動(dòng)為宜。

1.2.2 行為學(xué)觀察3組共18只大鼠均在實(shí)驗(yàn)前1 d及術(shù)后6 h、1 d、7 d和14 d進(jìn)行機(jī)械性觸誘發(fā)痛測(cè)定。將透明有機(jī)玻璃箱放置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)的鐵絲網(wǎng)架上，待測(cè)大鼠置于箱中適應(yīng)15 min后，用Von-frey絲垂直刺激小鼠右后肢的足底中部，使之稍彎成S形，持續(xù)時(shí)間不超過(guò)4 s，出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。當(dāng)該力度的刺激不能引起陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，則給予相鄰大1級(jí)力度的刺激；如出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，則給予相鄰小1級(jí)力度的刺激；如此連續(xù)進(jìn)行，每次間隔15 s。計(jì)算出50%縮足閾值，繪制大鼠機(jī)械性觸誘發(fā)痛曲線。

1.2.3 BNB滲透檢測(cè)1%EB溶于5%牛血清白蛋白制備成伊文斯藍(lán)蛋白染劑（Evans blue albumin，EBA）。3組共18只（n=6）大鼠術(shù)后1 d提取坐骨神經(jīng)，4%多聚甲醛固定90 min后，將其浸泡于2 mL的EBA溶液中1 h，再次甲醛固定，OCT膠包埋后切片，顯微鏡下拍照。每只大鼠取1張圖片，用Image J軟件測(cè)量神經(jīng)內(nèi)部EBA總灰度值，計(jì)算平均密度，以評(píng)價(jià)BNB通透性。

1.2.4 RT-PCR為節(jié)約實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，Control組（未做任何處理）只取6只大鼠的坐骨神經(jīng)作為所有時(shí)間點(diǎn)的陰性對(duì)照。3組共66只大鼠（n=6），分別于術(shù)前及術(shù)后6 h、1 d、7 d和14 d，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠后處死，提取坐骨神經(jīng)。采用Trizol提取液提取坐骨神經(jīng)總RNA，Nanodrop 2000分光光度計(jì)上測(cè)量總RNA濃度，使用cDNA-kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列：Claudin-1，上游引物：5’-GGGACAACATCGTGACTG CT-3’，下游引物：5’-CCACTAATGTCGCCAGACCTG-3’；GAPDH，上游引物：5’-AGTCTACTGGCGTCTTC AC-3’，下游引物：5’-TCATATTTCTCGTGGTTCAC-3’。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，隨后95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。以循環(huán)閾值（Ct值）作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果數(shù)據(jù)利用Applied Biosystems 7300 SDS軟件，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 Western blot Control組取6只大鼠的坐骨神經(jīng)（n=6）作為所有時(shí)間點(diǎn)的陰性對(duì)照。3組共66只大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后處死，提取坐骨神經(jīng)，勻漿，超聲粉碎，4500 g離心10 min后取上清。采用Bradford法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定蛋白濃度，并計(jì)算上樣量。蛋白樣品與緩沖液混合后，95℃水浴5 min變性，上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)含5%脫脂奶粉的TBST封閉液37℃封閉2 h，加入兔抗Claudin-1抗體（1∶1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（1:2000稀釋），室溫孵育2 h；使用Lumi-Light熒光試劑盒顯影并掃描測(cè)定Claudin-1蛋白光密度值。TBST洗膜后加入β-actin抗體（1∶25000稀釋），室溫孵育1 h后，再次使用Lumi-Light熒光試劑盒顯影并掃描測(cè)定β-actin蛋白光密度值。

1.2.6 免疫熒光染色3組共18只大鼠（n=6）術(shù)后1 d經(jīng)10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后處死，提取坐骨神經(jīng)。冰凍切片機(jī)制作坐骨神經(jīng)的橫斷切片，片厚10μm。標(biāo)本用3%BSA和1%羊血清封閉后，兔抗Claudin-1抗體1∶100稀釋后4℃孵育過(guò)夜，使用1∶500稀釋的Alexa Fluor 594結(jié)合羊抗兔IgG二抗常溫孵育60 min，再用DAPI行核染色10 min后，共聚焦顯微鏡下拍照。每只大鼠各選取1張圖片，采用Image J軟件測(cè)定神經(jīng)內(nèi)Claudin-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的綜合密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或雙因素方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠機(jī)械性觸誘發(fā)痛閾值變化

與Control組和Sham組相比，CCI組大鼠術(shù)后1 d右側(cè)后肢機(jī)械痛閾值降低，術(shù)后7 d降至最低，并且一直持續(xù)到術(shù)后14 d（均P＜0.05），見圖1。

注：與Control組比較，①P＜0.05，與Sham組比較，②P＜0.05

2.2 BNB滲透性變化

CCI組術(shù)后1 d，坐骨神經(jīng)EBA染色，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)3組大鼠的坐骨神經(jīng)外膜結(jié)構(gòu)完整，EBA染色連續(xù)均勻，Control組和Sham組的EBA集中在神經(jīng)外膜，未穿透BNB；CCI組的EBA穿過(guò)BNB，滲透入神經(jīng)內(nèi)部，見圖2?；叶戎刀糠治鼋Y(jié)果顯示，Control組和Sham組大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)EBA含量接近于零，CCI組EBA含量顯著增高（P＜0.05），見圖2。

2.3 坐骨神經(jīng)內(nèi)Claudin-1表達(dá)水平變化

RT-PCR測(cè)量結(jié)果顯示，術(shù)后6 h、1 d、7 d和14 d CCI組大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)Claudin-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著低于其他2組（均P＜0.05），且術(shù)后1 d下降幅度最為明顯，見圖3A。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，術(shù)后1 d、7 d和14 d，CCI組大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)Claudin-1蛋白表達(dá)水平顯著低于其他2組（均P＜0.05），見圖3B。

顯微鏡下觀察坐骨神經(jīng)切片，可見神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜較為完整，未見明顯破損。坐骨神經(jīng)免疫熒光染色顯示，Claudin-1蛋白主要分布于神經(jīng)內(nèi)膜和神經(jīng)束膜，見圖3C；CCI組坐骨神經(jīng)損傷后1 d，神經(jīng)束膜中Claudin-1蛋白熒光強(qiáng)度明顯下降，低于其他2組（均P＜0.05），見圖3D。

3 討論

本研究采用絲線結(jié)扎法制作CCI模型，結(jié)果顯示CCI組大鼠術(shù)后1 d右側(cè)后肢機(jī)械痛閾值降低，術(shù)后7 d降至最低，并且一直持續(xù)到術(shù)后14 d，造模成功。

外周神經(jīng)被神經(jīng)外膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜包繞。神經(jīng)外膜包繞在最外層，位于第2層的神經(jīng)束膜將神經(jīng)纖維分隔成束，并向內(nèi)延續(xù)形成神經(jīng)內(nèi)膜。神經(jīng)束膜和神經(jīng)內(nèi)膜組成BNB，將外周神經(jīng)與周圍組織隔離，維護(hù)外周神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保護(hù)神經(jīng)纖維[5]。在一些病理狀態(tài)下（如糖尿病神經(jīng)病變、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化等），BNB通透性常常被改變，神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡[6,7]。小鼠在坐骨神經(jīng)擠壓損傷后，BNB通透性增加，屏障功能減弱[2]；CCI大鼠術(shù)后3 h即出現(xiàn)BNB通透性增加，且作用可持續(xù)至術(shù)后2月[8]。這些研究結(jié)果均提示，神經(jīng)損傷引起的慢性疼痛中，BNB的通透性增加。

Lim KT等[3]首次發(fā)現(xiàn)BNB通透性的變化直接影響到疼痛的發(fā)展：坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎后，局部的巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子降低緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，從而增加BNB的通透性；受損的坐骨神經(jīng)中纖維蛋白原及炎性因子釋放增加，如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1α，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-β。這些致痛物質(zhì)穿過(guò)通透性增加的BNB，作用于外周神經(jīng)降低痛閾值，激活或者刺激細(xì)胞導(dǎo)致慢性疼痛狀態(tài)。本研究同樣發(fā)現(xiàn)大鼠在接受CCI手術(shù)后，雖然神經(jīng)束膜外觀正常，但是能夠滲透進(jìn)入坐骨神經(jīng)內(nèi)的EBA顯著增加，證明BNB完整性被破壞，通透性明顯增加。

圖2大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)EBA含量

圖3大鼠坐骨神經(jīng)Claudin-1表達(dá)水平變化

BNB的主要結(jié)構(gòu)由多種緊密連接蛋白（Occludin、Claudin、tricellulin等）及緊密連接的骨架蛋白ZO等組成[9]，其 中Claudin-1起 關(guān) 鍵 作 用。Claudin-1不 僅 是BNB的重要組成部分，同時(shí)也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)血腦屏障的重要組成部分，對(duì)維護(hù)整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起到了至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)周圍局部注射高滲鹽水（10%氯化鈉）[10]或重組纖溶酶原激活劑[4]，能夠降低神經(jīng)內(nèi)Claudin-1表達(dá)水平，增加BNB通透性。Reinhold等[7]發(fā)現(xiàn)小鼠在CCI術(shù)后7 d時(shí)坐骨神經(jīng)內(nèi)Claudin-1蛋白下調(diào)。本研究進(jìn)一步揭示了神經(jīng)病理性疼痛中Claudin-1的變化趨勢(shì)，結(jié)果表明CCI大鼠術(shù)后6 h時(shí)，Claudin-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平開始下降，術(shù)后1 d時(shí)，Claudin-1蛋白表達(dá)水平開始下降，一直持續(xù)到術(shù)后14 d。這提示，Claudin-1調(diào)節(jié)BNB通透性可能是神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)。

本課題深入觀察外周神經(jīng)受損后BNB通透性及緊密連接蛋白Claudin-1的變化，提示BNB在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的發(fā)揮重要作用，其通透性改變可能促進(jìn)炎癥因子進(jìn)入神經(jīng)內(nèi)部，從而導(dǎo)致疼痛的產(chǎn)生，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。降低神經(jīng)屏障的通透性可能會(huì)減少神經(jīng)內(nèi)部的炎癥因子，從而減緩或者抑制慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展，這將是疼痛治療的新靶點(diǎn)。