李在望，姜冬梅，韓晶，涂景梅，王倩

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后往往會造成受損平面以下肢體和軀干嚴重的運動、感覺功能缺損，大小便及性功能障礙，且這些缺損往往不可逆[1]。SCI后的神經(jīng)功能缺損由原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷所造成。原發(fā)性損傷是指原發(fā)疾病對脊髓造成的直接損傷，而繼發(fā)性損傷與SCI后過度炎癥反應及血脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）的破壞密切相關[2]。因此，SCI后如何控制炎癥反應和保護BSCB結構和功能的完整是減輕繼發(fā)性損傷的關鍵環(huán)節(jié)。

BSCB是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）特有的屏障結構，與血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）類似，其主要由脊髓微血管內皮細胞、星形膠質細胞、血管周圍的小膠質細胞、周細胞及基膜組成，是維持脊髓神經(jīng)組織微穩(wěn)態(tài)的高選擇性屏障結構[3]。目前有研究證實，在SCI后，BSCB結構的主要組成細胞（微血管內皮細胞、星形膠質細胞及小膠質細胞）出現(xiàn)表皮生長因子受體（epidemical growth factor recepter，EGFR）的大量活化[4-6]。EGFR是位于細胞質膜上的受體型酪氨酸蛋白激酶（tyrosine-protein kinase，TPK），在細胞存活、生長、分化、增生及凋亡等信號轉導通路中起著關鍵性調節(jié)作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR信號通路參與細胞屏障功能的調節(jié)，而微血管損傷、肺損傷及腸道內膜的通透性異常改變均與EGFR活化相關[8]。

有研究證實EGFR抑制劑能改善SCI后神經(jīng)功能缺損癥狀[5,6,9]，推測其機制可能與維持SCI后BSCB完整性，減輕脊髓繼發(fā)性損傷有關。本實驗通過建立BSCB體外模型，給予氧糖剝奪/復氧（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）處理，應用EGFR抑制劑PD168393對損傷的BSCB進行干預，觀察內皮細胞通透性、緊密連接蛋白的表達及BSCB細胞分泌炎癥因子的變化，以探討EGFR抑制劑PD168393對BSCB通透性的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

①實驗動物：新生24 h內SD大鼠10只，購自常州卡文斯實驗動物有限公司。②主要試劑：PD168393購于德國Calbiochem公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-右旋糖酐（dextranum）（F-D）購于美國Sigma公司；兔抗Occludin、小鼠抗ZO-1抗體均購于Invitrogen公司；白細胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-αELISA試劑盒均購于美國R&D公司；誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA試劑盒購于AVIVA公司。

1.2 方法

1.2.1 建立體外BSCB模型培養(yǎng)原代大鼠來源的脊髓微血管內皮細胞和混合膠質細胞，細胞95%融合后進行消化，重懸后以5×104/mL密度取1 mL接種在12孔板Transwell（聚酯膜，直徑12 mm，孔徑0.4μm）下室，作為滋養(yǎng)層；脊髓微血管內皮細胞取200μL接種在上室（Transwell嵌套內），建立上下雙層細胞共培養(yǎng)體系。貼壁后每2天換液1次。常規(guī)培養(yǎng)約7 d后，Transwell嵌套內脊髓微血管內皮細胞即可形成內皮細胞屏障樣組織，模擬BSCB組成細胞間的相互作用，建立體外BSCB模型[10]。

1.2.2 細胞分組①將體外培養(yǎng)的BSCB模型分為3組：對照組、損傷組和治療組。②損傷組和治療組細胞用PBS清洗上、下室3次，加入無糖無血清DMEM培養(yǎng)基；將Transwell及校準的測氧儀放入預缺氧小室中，通入95%N2，5%CO2直至測氧儀調至0.0～0.2，制造無氧環(huán)境。在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)6 h后，將2組細胞取出，更換為正常糖、血清的培養(yǎng)基，放入飽和濕度、正常含氧細胞培養(yǎng)箱中進行復氧（此時氧濃度約20%），復氧時間分別為3 h、6 h和12 h；其中治療組在復氧開始時即給予10 nM PD168393進行干預（給藥濃度參照既往研究報道）[11]。對照組細胞用含糖、含血清的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基洗滌3次，然后繼續(xù)放入正常溫度和含氧度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 熒光染料滲漏實驗將上述處理3組的上室培養(yǎng)液除去，在Transwell嵌套中加入200μL FITC-右旋糖酐（F-D）（1 mg/mL），置于培養(yǎng)箱中30 min。從各組底室分別取100μL（每孔取3次）置于96孔板，加入不同已知濃度的F-D，用熒光檢測儀在540 nm處讀取各孔溶液的熒光強度。根據(jù)標準曲線，計算各組滲透到底室的F-D濃度，評估滲透性隨時間的變化趨勢。

1.2.4 跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）測量使用來自美國EMD Millipore公司的Millicell ERS-2電阻儀測量3組在不同復氧時間點的TEER值。單位面積電阻/(Ω×cm2)=(所測得電阻值-空白電阻值)×有效膜面積（本實驗采用12孔板Tranwell系統(tǒng)，有效生長膜1.13 cm2）。

1.2.5 免疫熒光染色當各組細胞爬片的細胞長至95%融合時，取出爬片，常規(guī)4%多聚甲醛固定15～20 min，0.2%Triton/PBS液室溫透膜15 min，山羊血清白蛋白室溫封閉1 h，加預先用抗體稀釋液稀釋的一抗，于4℃冰箱中孵育過夜，用PBS替代一抗作為陰性對照；滴加二抗(1∶300)，室溫避光孵育1 h；加核染料DAPI工作液（1 mg/mL），室溫復染5 min；50%甘油封片；于熒光顯微鏡下觀察并照相；上述每一步操作間均用PBS洗5 min/次×3次。

1.2.6 Western Blot法OGD/R后6 h，收集各組細胞，加入裂解液冰上孵育并徹底勻漿，離心后留取上清，BCA法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；全濕式電轉法轉移到PVDF膜上；5%封閉液封閉2 h，分別加入一抗兔抗Occludin、小鼠抗ZO-1（1∶1000）；內參為GAPDH（1∶500），4℃孵育過夜。用TBST溶液洗滌10 min/次×3次；加入HRP標記羊抗鼠、羊抗兔IgG二抗（1∶1000），4℃過夜；TBST洗膜10 min/次×3次，加ECL發(fā)光顯示液在暗室中攝像，凝膠成像分析系統(tǒng)進行分析。

1.2.7 ELISA法ELISA法測定各組細胞分泌的致炎因子IL-6、TNF-α、iNOS，具體操作步驟按ELISA試劑盒的說明進行。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EGFR抑制劑對OGD/R誘導的BSCB損傷模型通透性的影響

對照組滲透到底室F-D的平均濃度為（230±34）nmol/L；損傷組的F-D濃度在復氧3 h、6 h和12 h分別為（280±53）nmol/L、（300±57）nmol/L和（270±42）nmol/L，均高于對照組（P＜0.05或P＜0.01）；治療組的F-D濃度在復氧3 h、6 h和12 h分別為（240±39）nmol/L、（250±40）nmol/L和（238±33）nmol/L，均低于損傷組（均P＜0.05），見圖1 A。損傷組的TEER值在復氧3 h、6 h、12 h后均低于對照組（均P＜0.01），而治療組在這3個時間點，所測TEER值均高于損傷組（均P＜0.05），見圖1B。

2.2 EGFR抑制劑對OGD/R誘導的BSCB損傷模型緊密連接蛋白表達的影響

與對照組相比，損傷組緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達量顯著降低（均P＜0.05），而治療組ZO-1和Occludin的表達量較損傷組顯著升高（均P＜0.05），見圖2A、B。免疫熒光染色結果顯示，對照組細胞排列緊密，呈條索狀排列，符合正常內皮細胞生長形式，緊密連接蛋白ZO-1和Occludin在細胞間呈連續(xù)性的線條樣外觀，見圖2C1、D1；損傷組ZO-1和Occludin表達量顯著下調，線條顯著變細，部分線條斷裂或部分缺損，見圖2C2、D2；治療組ZO-1和Occludin熒光線條雖仍有缺損，但較損傷組的斷裂和缺損均明顯減少，表達均有所增加，見圖2C3、D3。

2.3 EGFR抑制劑對OGD/R誘導的BSCB損傷模型致炎因子表達的影響

ELISA結果顯示，與對照組相比，損傷組分泌的致炎因子IL-6、iNOS、TNF-α均顯著上調。IL-6在OGD/R 6 h時表達量增幅最大，見圖3A。iNOS、TNF-α在OGD/R后的表達也增加，呈緩慢上升的趨勢，見圖3B、C。OGD/R 12 h時，損傷組IL-6、iNOS分泌逐漸減少，而TNF-α仍有持續(xù)的高表達。治療組在各時間點致炎因子IL-6、iNOS、TNF-α的分泌均較損傷組顯著下調（均P＜0.05），見圖3。

3 討論

BSCB是CNS高度分化的神經(jīng)血管特殊化內皮結構，而微血管內皮細胞是BSCB重要組成細胞[3]。緊密連接蛋白是微血管內皮細胞分泌的一種特殊蛋白，可填補內皮細胞間隙，使內皮細胞形成緊密連接狀態(tài)，對BSCB的功能維持有極其重要的意義[12]。ZO-1和Occludin是緊密連接的主要蛋白質，也被認為是CNS屏障結構正?；驌p壞時的敏感標記物[12]。Occludin是第1個被發(fā)現(xiàn)的完整的緊密連接膜蛋白，分子量56 kDa，可以通過羧基與ZO-1連接[12]。Occludin在CNS血管內皮上的表達較非神經(jīng)組織的高，這是BBB與BSCB通透性明顯低于其它血組織屏障的重要原因之一[12]。ZO-1蛋白不僅作為細胞內多個信號通路的支架，也涉及緊密連接蛋白的調節(jié)功能[12]。在SCI的過程中，ZO-1通過輔助緊密連接裝配、傳遞相鄰細胞間的信號、影響血管內皮細胞的基因表達等途徑，參與BSCB通透性變化的過程[13]。

圖1各組BSCB在OGD/R處理后的通透性

圖2 EGFR抑制劑對OGD/R處理后BSCB緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達量的影響

有研究證實在SCI后BSCB通透性增大，緊密連接蛋白表達減少[14,15]。本研究構建體外BSCB模型OGD/R損傷后，免疫熒光顯示損傷后的BSCB緊密連接蛋白表達減少，熒光染料滲漏實驗及內皮細胞跨膜電阻檢測均證實BSCB在損傷后通透性明顯增加，說明BSCB的結構破壞、屏障功能受損。在western blot和免疫熒光檢測中發(fā)現(xiàn)，治療組緊密連接蛋白的表達較損傷組增加，說明EGFR抑制劑有助于減輕BSCB損傷后緊密連接蛋白的破壞。本研究結果還顯示，體外BSCB在OGD/R損傷后致炎因子（TNF-α、IL-6、iNOS）分泌明顯增加，而應用EGFR抑制劑干預后致炎因子的表達明顯下調。有研究證實致炎因子的表達與緊密連接蛋白表達呈負性相關，抑制過度的炎癥反應可減少緊密連接蛋白缺失，保護BSCB完整性[10]。

目前有多個研究證實EGFR抑制劑對CNS損傷有保護作用[5-7,9]，但其作用機制一直未完全明確。目前有研究證實SCI后活化的星形膠質細胞和小膠質細胞均出現(xiàn)EGFR大量活化，EGFR抑制劑既能有效抑制星形膠質細胞和小膠質細胞EGFR活化，又能明顯抑制過度的膠質增生[5,6,9]。SCI后BSCB的破壞和膠質細胞活化引發(fā)的炎癥反應是導致脊髓繼發(fā)損傷的2個關鍵病理改變[16]。SCI后BSCB破壞導致血液中白細胞和致炎因子進入神經(jīng)組織，激活星形膠質細胞、小膠質細胞[2]。膠質細胞活化后引發(fā)炎癥損傷反應，不僅導致神經(jīng)元和少突膠質細胞損傷，還進一步破壞BSCB的完整性，使脊髓繼發(fā)性損傷作用不斷放大，形成脊髓組織炎癥損傷的惡性循環(huán)（即正反饋損傷）[10,17]。阻斷這一炎癥損傷的惡性循環(huán)是治療SCI的一個重要策略。根據(jù)本研究結果，我們推測在BSCB損傷后應用EGFR抑制劑，可能通過抑制膠質細胞EGFR的活化而減緩膠質細胞的過度增生，減少過度的炎癥反應所造成的炎癥損傷，起到保護BSCB的作用。

綜上所述，EGFR抑制劑PD168393可減少BSCB在OGD/R損傷后致炎因子的表達，并減少BSCB緊密連接蛋白的脫失，維護BSCB的完整性。

圖3 EGFR抑制劑對OGD/R處理后BSCB分泌致炎因子的影響