陳梓杰，陳柏行，許隆，張嚴，馮俊銘，李世杰，高怡加，曾展鵬

神經(jīng)源性異位骨化（neurogenic heterotopic ossification，NHO）是指中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后板層骨在肌肉、肌腱、韌帶等非骨骼組織中的異位生長，常見于創(chuàng)傷性顱腦損傷和脊髓損傷。異常的骨組織常引起疼痛，關(guān)節(jié)活動受限等并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。非甾體類抗炎藥和雙膦酸鹽可在一定程度上預(yù)防NHO，然而一旦異位骨形成后，藥物干預(yù)的收效甚微，手術(shù)切除是唯一的治療方式，但術(shù)后高復(fù)發(fā)率成為困擾醫(yī)生的難題[2]。目前，NHO確切的病理生理機制仍未明確，了解其發(fā)病機制對預(yù)防和治療NHO具有重要的意義。

Chalmers[3]最早指出發(fā)生異位骨化需要滿足3個條件：存在骨誘導(dǎo)因子、成骨前體細胞和允許成骨的環(huán)境。NHO的形成可能通過損傷的神經(jīng)組織分泌誘導(dǎo)因子與軟組織中成骨前體細胞相互作用，使細胞趨化、增殖，并成骨分化，最終激活異位成骨。實驗發(fā)現(xiàn)腦損傷后的血清促進骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的增殖，并增強細胞內(nèi)血清堿性磷酸酶的表達[4]，提示BMSCs可能是損傷中樞神經(jīng)釋放骨誘導(dǎo)因子的作用部位，但目前對于BMSCs參與NHO形成的分子機制研究仍較少?；蛭㈥嚵屑夹g(shù)已廣泛應(yīng)用于人類疾病研究，可用于尋找疾病相關(guān)基因、治療靶點和生物標志物[5]。本文試通過分析基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中NHO基因芯片，尋找關(guān)鍵基因及信號通道，為深入了解發(fā)病機制和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)的獲取與預(yù)處理

下載GEO中基因表達譜芯片系列GSE94683。該系列包含16個樣本，分成NHO組（n=7）及健康對照組（n=9）。所有樣本提取的來源均為BMSCs。我們通過R軟 件（v3.6.1）的preprocess Core軟 件 包 中 的normalize.quantiles（）函數(shù)對原始數(shù)據(jù)集進行分位數(shù)歸一化，得到的標準化表達矩陣用Log2轉(zhuǎn)換計算表達值。對原始數(shù)據(jù)進行注釋，當存在多個探針對應(yīng)同一個基因名時對其合并取均值。

1.2 差異基因的篩選

使用R軟件的Limma包篩選差異表達基因（Differentially expressed genes，DEG）。采用Benjamini-Hochberg法進行多重比較和控制假陽性率，以調(diào)整后的P＜0.05和差異倍數(shù)|Log 2(fold-change)|＞2作為閾值，并繪制火山圖及熱圖。

1.3 基因本體論與KEGG通路富集分析

基因本體論（Gene Ontology，GO）分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析是進行基因功能注釋和通路富集分析的常用方法。本研究將篩選得到的DEG提交到Metascape在線工具（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）進行分析，確定這些DEG的關(guān)鍵生物學(xué)過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF），細胞成分（cellular component，CC）和KEGG通路后，運用R軟件生成散點圖。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和hub基因識別

通過Metascape數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用信息（protein-protein interaction，PPI）分析功能，可識別NHO組和對照組之間的核心基因。用來構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)主要來源于BioGrid[6]，InWeb_IM[7]，OmniPath[8]數(shù)據(jù)庫。將Metascape導(dǎo)出的數(shù)據(jù)利用Cytoscape（V3.8.0）軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并以節(jié)點連接度為標準排序PPI網(wǎng)絡(luò)中的hub基因。利用分子復(fù)雜檢測（MCODE）算法對Cytoscape中的PPI網(wǎng)絡(luò)的中的典型模塊進行篩選。

2 結(jié)果

2.1 差異表達分析

將芯片數(shù)據(jù)標準化后，共識別出276個DEG，包括150個上調(diào)基因和126個下調(diào)基因，見圖1。對前25個上調(diào)基因和25個下調(diào)基因進行可視化，藍色表示基因表達上調(diào)，白色表示表達無差異，粉色表示表達下調(diào)，結(jié)果顯示差異基因表達水平在2組間具有較好的組間一致性，見圖2。

2.2 差異基因的富集分析

Metascape工具用于DEG的功能和途徑富集分析，圖中點的大小代表該術(shù)語/通路富集的差異基因數(shù)；點的顏色代表調(diào)整后的P值，表示通路富集的顯著性程度；橫坐標GeneRatio為對應(yīng)術(shù)語/通路的差異基因占該術(shù)語/通路包含所有基因的比例，見圖3。GO富集分析包含BP、MF與CC 3個方面，BP主要在化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)（modulation of chemical synaptic transmission）、跨突觸信號的調(diào)控（regulation of trans-synaptic signaling）和骨化（ossification）等過程富集，見圖3A。MF主要富集在細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（extracellular matrix structural constituent）、肝素結(jié)合（heparin binding）和糖胺聚糖結(jié)合（glycosaminoglycan binding），見圖3 B。DEG的CC主要富集在膠原三聚體（collagen trimer）、含膠原的細胞外基質(zhì)（collagen-containing extracellular matrix）和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix），見圖3 C。KEGG通路分析表明，DEG主要在補體與凝血級聯(lián)（complement and coagulation cascades）、IL-17信號通路（IL-17 signal pathway）、Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）、蛋白質(zhì)消化吸收（protein digestion and absorption）等通路富集，見圖3 D。

圖1表達譜差異分析的火山圖

圖2差異度大小排名前25的上、下調(diào)基因熱圖

為了進一步探索術(shù)語之間的關(guān)系，我們選擇了富集的術(shù)語作為節(jié)點，構(gòu)建術(shù)語富集網(wǎng)絡(luò)：圖4（A）展示了不同術(shù)語之間的相關(guān)性，越接近則說明相似性越高，顏色表示不同的聚類；圖4（B）根據(jù)P值大小對節(jié)點進行著色，P值越小，表示該術(shù)語的富集程度越高。

圖5展示了各通路與相關(guān)差異基因的網(wǎng)絡(luò)圖，黃色箭頭代表富集的通路，節(jié)點代表在該通路的差異基因。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選

通過Metascape在線工具對DEG進行分析尋找蛋白質(zhì)之間的相互作用，并使用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化，得到1個包含76個節(jié)點，96個連接的網(wǎng)絡(luò)，見圖6。通過Cytohubba工具篩選出連接度最高的前10個hub基因，分別為EGF、GPR18、ADRA2C、CXCL1、C3、CXCL6、ADRB2、PENK、CXCL2、CDH1，見圖7。Metascape網(wǎng)站內(nèi)置MCODE算法，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析對基因網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析，共篩選出4個模塊，見圖6。根據(jù)Metascape節(jié)點中的鄰接度及密度，每個模塊包含1個種子節(jié)點作為該模塊的關(guān)鍵基因[9]，分別為：CXCL2、PTH2、EphB1、HTR2B。從hub基因和模塊基因比對中可以發(fā)現(xiàn)，連接度前10的hub基因中包含了所有模塊1的基因，說明模塊1可能在參與疾病調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用。

3 討論

神經(jīng)源性異位骨化多發(fā)生在中樞神經(jīng)損傷的患者，早期發(fā)病隱匿，藥物及物理療法的療效不理想，手術(shù)干預(yù)后復(fù)發(fā)率高，且目前對NHO確切發(fā)病機制知之甚少。

本研究通過對基因芯片GSE94683進行生物信息學(xué)分析，篩選出150個上調(diào)基因和126個下調(diào)基因，GO富集分析表明NHO參與的分子機制主要富集在化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、跨突觸信號的調(diào)控、骨化、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、肝素結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、膠原三聚體、含膠原的細胞外基質(zhì)、細胞外基質(zhì)。富集的KEGG通路有：補體與凝血級聯(lián)、IL-17信號通路、Wnt信號通路、蛋白質(zhì)消化吸收。構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)篩選10個hub基因：EGF、GPR18、ADRA2C、CXCL1、C3、CXCL6、ADRB2、PENK、CXCL2、CDH1。同時篩選出4個具有生物學(xué)相關(guān)性的模塊，對應(yīng)種子基因分別為CXCL2、PTH2、EPHB1、HTR2B。

表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）被鑒定為PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的hub基因。EGF是一種生長因子，也是一種有絲分裂原，與表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶活性，促進信號級聯(lián)，參與細胞增殖、有絲分裂。Laflamme等[10]證明了EGF參與了促成骨細胞分化的早期階段，然而Liu等[11]研究顯示EGF本身不能誘導(dǎo)未分化MSCs的成骨分化，但可增強BMP9介導(dǎo)的MSCs的異位成骨能力。同時，Lee等[12]也發(fā)現(xiàn)用BMP-2和EGF處理的BMSCs，成骨標志物ALP、BSP、OPN和OST的表達比單純BMP-2處理組明顯增加，提示EGF在與BMP協(xié)同作用下可誘導(dǎo)骨礦化。而BMP信號通路被公認為異位骨化的共同信號通路，在一種脊髓損傷的NHO動物模型中，BMP2、BMP4、BMP7和BMP9的表達顯著增強[13]。這些證據(jù)指向了EGF在NHO中可能協(xié)同BMP調(diào)節(jié)促進MSCs的成骨分化與礦化。

圖3富集分析散點圖

圖5 KEGG富集通路-差異基因網(wǎng)絡(luò)

圖6 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖7連接度最高的前10個hub基因

CXC基序趨化因子配體2（CXC Motif Chemokine Ligand 2，CXCL2）為模塊1的種子基因，CXCL2是一種細胞因子，主要通過趨化中性粒細胞來調(diào)節(jié)免疫功能[14]。研究顯示CXCL2在破骨細胞生成過程中也發(fā)揮了作用，Ha等[15]的研究證明CXCL2可增強破骨前體細胞的遷移，促進RANKL介導(dǎo)破骨前體細胞向破骨細胞分化。骨重塑依賴于骨形成與骨吸收結(jié)合的骨穩(wěn)態(tài)調(diào)控平衡，抑制破骨細胞分化可減少骨吸收，間接增強骨形成，這與本研究中CXCL2表達下調(diào)的結(jié)果相一致。我們認為CXCL2在NHO形成中參與的機制可能是通過抑制MSCs旁分泌從而減弱RANKL介導(dǎo)的破骨細胞遷移和分化。

作為模塊2的種子基因，甲狀旁腺激素2（Parathyroid Hormone 2，PTH2）是與甲狀旁腺激素具有編碼序列相似性的肽激素前體，通過與甲狀旁腺激素2型受體（Parathyroid hormone type 2 receptor，PTH2R）結(jié)合，參與G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)途徑。Oki等[16]發(fā)現(xiàn)PTH2干預(yù)可明顯增強兔股骨干骺端內(nèi)間隙的骨形成。模塊2中又同時存在PTH1R，然而PTH1R可被PTHrP激活卻不能被PTH2激活。Zhang等[17]的實驗證明了通過激活PTH1R增強SOX9的表達，促進MSCs的軟骨分化。而本研究中PTH2與PTH1R均上調(diào)，推測這2個基因可能通過協(xié)同促進MSCs分化為軟骨表型，并以軟骨內(nèi)成骨方式產(chǎn)生異位骨。

模塊3的種子基因是促紅細胞生成素產(chǎn)生肝細胞受體B1（erythropoieti-producing hepatocellular receptor B1，EphB1），是受體酪氨酸激酶的最大亞族Eph受體家族的一員，與跨膜蛋白Ephrins配體以細胞-細胞接觸介導(dǎo)的方式傳遞雙向信號，Eph受體下游的信號傳導(dǎo)途徑稱為正向信號傳導(dǎo)，而Ephrins配體下游的信號傳導(dǎo)途徑為反向信號傳導(dǎo)[18]。體外實驗觀察到顱骨成骨前體細胞中EphB2和EphB1的表達，并且EphB1基因敲除的小鼠顱骨骨量減少[19]。與此同時，劉軍等[20]發(fā)現(xiàn)EphrinB2調(diào)節(jié)BMSCs的OPG/RANKL比率上調(diào)，抑制了對骨微環(huán)境中破骨細胞的分化，減少了骨吸收。這些發(fā)現(xiàn)提示NHO發(fā)生的調(diào)控機制可能為EpHB1激活的雙向信號介導(dǎo)成骨-破骨耦聯(lián)，促進了MSCs的成骨分化，同時抑制破骨細胞分化。

模塊4的種子基因5-羥色胺受體2B（5-Hydroxytryptamine receptor 2B，HTR2B）為5-HT的受體，5-HT是一種神經(jīng)遞質(zhì)，除了在大腦中發(fā)揮重要的作用外，5HT-HTR2B通路也參與了骨形成過程。據(jù)報道，HTR2B激活可以調(diào)節(jié)胚胎小鼠后肢MSCs的增殖[21]；同時，Locker等[22]發(fā)現(xiàn)通過HTR2B可激活下游的NO信號通路和磷脂酶A2信號通路，釋放NO及花生四烯酸，促進成骨前體細胞粘附、成骨分化及礦化，這提示HTR2B可能在NHO形成中發(fā)揮了作用。

綜上所述，NHO的發(fā)生存在多靶點、多途徑調(diào)控機制，這些基因和作用通路可能成為未來治療NHO的方向，值得進一步的研究驗證。