張晶晶 方 翌 劉麗雅 沈阿靈 沈志清 張 鈴 彭 軍 魏麗慧 陳友琴

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.美國凱斯西儲大學醫(yī)學院，俄亥俄州 克利夫蘭 44106）

據(jù)美國癌癥協(xié)會2020年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，大腸癌（colorectal cancer，CRC）在致死性癌癥中占第三位，美國每年有超過150萬新發(fā)病例，其中死亡人數(shù)高達 1／3［1］。研究表明，腫瘤干細胞是癌癥治療后復發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的關鍵因素，這些細胞在實體瘤組織中占比較小，并具有自我更新、高成瘤能力、多向分化等生物學特性［2-3］。其中，自我更新是腫瘤干細胞的基本特征，指其通過對稱或不對稱分裂產(chǎn)生至少一個保留干細胞特性子細胞的過程，可使癌細胞無限增殖，從而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展［4］。因此，如何抑制大腸癌干細胞的自我更新和成瘤能力及其機制研究，對防治大腸癌具有重要意義。半枝蓮（Scutellaria barbataD.Don）系唇形科黃芪屬植物，功效清熱解毒、化瘀散結，對大腸癌、胃癌等惡性腫瘤均有良好療效［5］。課題組前期實驗表明半枝蓮具有降低大腸癌干細胞比例及誘導其調(diào)亡的作用［6-7］，但對大腸癌干細胞自我更新功能和體內(nèi)成瘤能力的作用及機制尚未闡明。因此，本課題研究半枝蓮對大腸癌干細胞自我更新和成瘤能力的影響及可能的調(diào)控通路。

1 實驗材料

1.1 藥物和細胞株 半枝蓮購自福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂；人源SW480大腸癌細胞株購自上海中科院細胞庫。

1.2 實驗動物 4～5周齡SPF級BALB／c雄性裸鼠，8只，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，實驗動物合格證號：2015000553480。

1.3 實驗試劑 DMEM／F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、B-27、Antibiotic-Antimycotic、StemPro Accutase cell Dissociation Reagent（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基（江蘇凱基生物公司）；表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，F(xiàn)GF-basic）（美國 Peprotech 公司）；一抗 Nanog、SRY 同源框 2（SRY homology box 2，SOX2）、八聚體結合轉(zhuǎn)錄因子（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）、磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）、蛋白激酶 B（Akt）、GAPDH、β-actin 及鼠二抗、兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.4 實驗儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱、低速離心機（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；MOFLO XDP分選型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)（美國BD Biosciences公司）；電泳儀、電泳槽、化學發(fā)光凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 常用試劑配制

2.1.1 半枝蓮溶液的配制 參照文獻［6］中的方法制備半枝蓮乙醇提取物，用PBS和DMSO按1∶1比例配制成濃度為500 mg／mL的半枝蓮溶液，超聲30 min，待溶解后分裝，并儲存于-20℃。

2.1.2 大腸癌干細胞培養(yǎng)基配制 在不含胎牛血清的 DMEM／F12培養(yǎng)基中加入 20 ng／mL EGF、20 ng／mL FGF-basic、1×B-27 和 1%Antibiotic-Antimycotic，分裝儲存于0℃。

2.2 大腸癌干細胞培養(yǎng) 采用側群細胞分選法分離大腸癌干細胞［8］，收集大腸癌干細胞后用PBS清洗1次，加入配置好的干細胞培養(yǎng)基，并按照1.5×103個／mL密度接種在超低粘附6孔板中培養(yǎng)。

2.3 克隆球?qū)嶒?將大腸癌干細胞按3×105個／mL的密度接種于超低黏附6孔板培養(yǎng)過夜后，用不同濃度的半枝蓮（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預 24 h，然后消化離心收集細胞重新按5×102個／mL的密度分別接種于超低粘附6孔板，在干細胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)10 d。期間，每隔3 d添加1 mL干細胞培養(yǎng)基。最后移至96孔板，采用高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)在10×物鏡下，以10×10的模式進行圖片采集，并進行計數(shù)。

2.4 皮下移植瘤模型 將BALB／c雄性裸鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房微生物隔離籠中，添加無菌墊料、飼料、水。適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。大腸癌干細胞經(jīng)半枝蓮（0、0.5 mg／mL）干預后，調(diào)整細胞數(shù)，用PBS（50 μL）和基質(zhì)膠（50 μL）混合液重懸，采用皮下注射法，按 1 000 個細胞 ／只（100 μL／只），注射到小鼠的右腋下（對照組4只，半枝蓮0 mg／mL；實驗組4只，半枝蓮0.5 mg／mL）。接種后每日觀察小鼠狀態(tài)及瘤體生長情況，49 d后用過量異氟烷處死小鼠，剝除所有腫瘤并稱重。動物實驗均嚴格按照《福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心動物實驗協(xié)議書及承諾書》中的標準進行。

2.5 Western blot檢測 Nanog、SOX2、OCT4、p-Akt、Akt蛋白的表達 用不同濃度半枝蓮（0、0.25、0.5、0.75 mg／mL）干預大腸癌干細胞24 h后，棄上清，用預冷的PBS清洗2次，加入細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），在冰上裂解30 min以提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液（5×SDS-PAGE）使蛋白變性，然后進行SDS-PAGE電泳（90 V，45 min；120 V，55 min），接著用 PVDF 膜進行轉(zhuǎn)膜（110 V，60 min）。轉(zhuǎn)膜結束加封閉液封閉1 h，按目的蛋白分子量大小進行裁膜，并加入對應的一抗 Nanog（1∶2 000）、SOX2（1∶1 000）、OCT4（1∶1 000）、p-Akt（1∶2 000）、Akt（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃搖床孵育 14～16 h。一抗孵育結束后用1×TBST清洗3次，每次10 min。再加入兔二抗或鼠二抗（1∶5 000）常溫孵育1 h，二抗孵育后用1×TBST清洗3次，每次10 min。用ECL化學發(fā)光法顯影，在化學發(fā)光凝膠成像儀上檢測蛋白表達。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊，用t檢驗；不符合正態(tài)分布，則用Wilcoxon秩和檢驗。多組數(shù)據(jù)之間比較采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 半枝蓮對大腸癌干細胞體外成球能力的影響

在倒置顯微鏡下觀察克隆球數(shù)目，可見0 mg／mL組細胞生長密集，成球狀況良好，而不同濃度半枝蓮干預后克隆球數(shù)目較0 mg／mL組均明顯減少（P＜0.05），且隨濃度的增加克隆球數(shù)目遞減，見圖1。

圖1 半枝蓮對大腸癌干細胞體外成球能力的影響（×100）

3.2 半枝蓮對大腸癌干細胞體內(nèi)成瘤能力的影響

皮下接種后，隨時間推移，可見對照組裸鼠瘤體體積逐漸增大，而實驗組瘤體生長較為緩慢，49 d后剝除瘤體，發(fā)現(xiàn)實驗組的瘤體明顯比對照組小，見圖2。進一步稱量瘤體質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)實驗組的瘤體質(zhì)量較對照組顯著降低（P＜0.05）。

圖2 半枝蓮對大腸癌干細胞體內(nèi)成瘤能力的影響

3.3 半枝蓮對 Nanog、SOX2、OCT4蛋白表達的影響 與0 mg／mL組相比，不同濃度的半枝蓮干預24 h后均能明顯下調(diào)Nanog、SOX2、OCT4的蛋白表達水平（圖3），且抑制作用隨著半枝蓮的濃度增加而變強。

3.4 半枝蓮對p-Akt、Akt蛋白表達的影響 與0 mg／mL組相比，不同濃度的半枝蓮干預24 h后，均能明顯抑制Akt的磷酸化，見圖4。

圖3 半枝蓮對大腸癌干細胞Nanog、SOX2、OCT4蛋白表達的影響

圖4 半枝蓮對大腸癌干細胞p-Akt、Akt蛋白表達的影響

4 討論

大腸癌是臨床常見的難治性消化道腫瘤，目前臨床療法以手術切除和化療為主［9］，但術后易發(fā)生臟器轉(zhuǎn)移，導致患者生存率降低［10］；化療又伴隨毒副作用，嚴重危害患者生存質(zhì)量。針對上述局限性，近年來中醫(yī)藥抗腫瘤研究逐漸興起。中醫(yī)藥在防治癌癥方面具有多組分、多靶標、副作用少等獨特的優(yōu)勢，但目前研究多集中在抗腫瘤細胞方向，對腫瘤干細胞的研究較少，而腫瘤干細胞才是癌癥轉(zhuǎn)移的關鍵［11］。腫瘤干細胞是實體瘤中一小群明顯不同的細胞亞群，相當于癌組織里的“種子細胞”，通常處于休眠狀態(tài)，可逃脫外界傷害，當環(huán)境適宜時則惡性增殖，并易產(chǎn)生遠處轉(zhuǎn)移，從而導致腫瘤復發(fā)。因此，研究能抑制大腸癌干細胞自我更新和成瘤能力的中藥及其調(diào)控機制，有望解決大腸癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移這一難題。

半枝蓮是臨床常用抗癌中藥，研究表明它含有黃酮、多糖、二萜等活性物質(zhì)，這些有效成分可調(diào)節(jié)免疫、抑制癌細胞生長和腫瘤血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤功效［12-16］。克隆球?qū)嶒灲Y果顯示，相比0 mg／mL組，半枝蓮干預后大腸癌干細胞成球數(shù)目明顯減少；裸鼠皮下移植瘤實驗顯示，實驗組大腸癌干細胞所形成的瘤體質(zhì)量較對照組顯著減輕。體內(nèi)外實驗綜合表明半枝蓮可抑制大腸癌干細胞的體外自我更新能力和體內(nèi)成瘤能力。

據(jù)報道，腫瘤干細胞的自我更新和成瘤能力受到多條信號通路調(diào)控，其中Akt信號通路的異?；罨墙?jīng)典的轉(zhuǎn)導通路之一［17-18］。Akt蛋白屬于AGC激酶家族，最初被描述為病毒癌基因的人類同源物，可調(diào)控細胞代謝、增殖、癌癥發(fā)生等生理病理過程［19-20］。研究表明，活化的Akt存在于大腸癌組織中，且與大腸癌患者預后不良有關［21］。當Akt通路受細胞外信號刺激時，可發(fā)揮細胞內(nèi)下游效應子功能，通過聚集Akt并轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜后，在磷酸肌醇依賴性激酶1（PDK1）和雷帕霉素復合物激酶2（mTORC2）的活化作用下，促進磷酸化，最終活化的Akt會進一步誘導多種底物磷酸化，從而維持腫瘤干細胞的自我更新和成瘤能力［22］，該途徑中重要的下游靶基因主要有 Nanog、SOX2、OCT4 等［23］。 Nanog 是一種同源結構域轉(zhuǎn)錄因子，在維持干細胞多能性和自我更新中起著重要作用［24］。ALMOZYAN 等［25］發(fā)現(xiàn)下調(diào)PD-L1可通過激活Akt信號通路靶向Nanog，從而抑制乳腺干細胞的體外自我更新能力和體內(nèi)成瘤能力。SOX家族涉及癌細胞生長遷移、克隆球形成和成瘤能力［26］，其中，SOX2是維持腫瘤干細胞特性所必需的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子［27］，ZHOU 等［28］發(fā)現(xiàn)過表達miR-135b可通過激活AKT／mTOR途徑增加SOX2的表達，并最終促進胰腺癌干細胞自我更新和成瘤能力。OCT4也調(diào)控干細胞多能分化和自我更新［29］，ZHU等［30］發(fā)現(xiàn)通過靶向轉(zhuǎn)錄因子ZIC2可激活OCT4，促進克隆球形成及小鼠異種移植瘤生長，從而驅(qū)動肝癌干細胞自我更新和成瘤能力。

因此，本課題通過檢測與大腸癌干細胞中自我更新和成瘤能力相關標志物Nanog、SOX2、OCT4及Akt信號通路中p-Akt、Akt蛋白的表達，探討半枝蓮抑制大腸癌干細胞自我更新和成瘤能力的分子機制。本研究結果顯示，經(jīng)半枝蓮干預后，大腸癌干細胞中Nanog、SOX2、OCT4的表達明顯下調(diào)，且Akt的磷酸化被顯著抑制。提示通過抑制Akt信號通路的活化可能是半枝蓮抑制大腸癌干細胞自我更新和成瘤能力的重要機制之一。