張 鈴 方 翌 林久茂 蔡巧燕 魏麗慧 熊曉滿 劉 菲 鄭小紅 俞詩雅 林燕濱

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其病死率位居全球第二［1］。 在過去的 50 年，5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是治療大腸癌最常用的藥物。然而，患者對5-FU產(chǎn)生耐藥在很大程度上限制了其治療的有效性［2］。因此，探討大腸癌對5-FU產(chǎn)生耐藥的潛在分子機(jī)制，并探索5-FU耐藥的新診斷生物標(biāo)記物已迫在眉睫。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于 200 bp的非編碼RNA，具有5’帽子和 poly尾巴，通過剪接形成成熟的lncRNA，不具有或很少具有編碼蛋白的功能。目前研究已發(fā)現(xiàn)，lncRNA具有數(shù)量多、類型多、功能多等特點，它們參與了調(diào)控基因表達(dá)的各個階段，包括染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)翻譯以及翻譯后的調(diào)控［3］，而許多l(xiāng)ncRNA已被證實在腫瘤的耐藥中起到了重要的調(diào)控作用［4］。目前的最新研究顯示，中藥能夠通過調(diào)控lncRNA逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥［5］。半枝蓮具有清熱解毒、利尿散瘀等功效，在臨床上常單用或聯(lián)合應(yīng)用于治療各種腫瘤，包括肺癌、乳腺癌和大腸癌等，并且取得較好的療效［6］。本課題組前期研究表明半枝蓮?fù)ㄟ^“多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點”方式起到抗大腸癌的作用［7-11］。同時，半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB）是逆轉(zhuǎn)大腸癌5-FU耐藥最有效的部位提取物［12］，且作用機(jī)制可能與下調(diào)LRP基因有關(guān)［13］。但半枝蓮能否通過調(diào)控lncRNA的表達(dá)逆轉(zhuǎn)大腸癌對5-FU的耐藥，仍需進(jìn)一步研究。因此，本實驗初步研究linc01843與5-FU耐藥的相關(guān)性，并進(jìn)一步研究半枝蓮對其的調(diào)控作用。

1 實驗材料

1.1 實驗細(xì)胞與藥物 半枝蓮購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂。人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8和耐5-FU細(xì)胞株HCT-8／5-FU均購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白 酶 、Trizol、lipofectamine 3000、Opti-MEN 培 養(yǎng)基［美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；引物合成于上海生物工程有限公司；si-linc01843合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；HiScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒以及ChamQTM SYBR qPCR預(yù)混液（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（Heal Force公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國徠卡儀器有限公司）；多功能酶標(biāo)［美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；PCR擴(kuò)增儀（美國伯樂公司）。

2 實驗方法

2.1 半枝蓮提取物的制備 用5 000 mL的85%乙醇將半枝蓮（500 g）回流提取3次并過濾。用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇溶劑進(jìn)行萃取，得到半枝蓮的石油醚（EPESB）、氯仿（ECSB）、乙酸乙酯（EEASB）、正丁醇（ENBSB）的極性部位提取物。然后將這些提取物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)，得到的浸膏用二甲亞砜（DMSO）超聲溶解。其中，ECSB的終濃度為 200 mg／mL，并在-20℃儲存。

2.2 HCT-8和HCT-8／5-FU細(xì)胞培養(yǎng) 親本HCT-8細(xì)胞和5-FU耐藥HCT-8／5-FU細(xì)胞均在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)（含10%胎牛血清，100 U／mL青霉素和 100 μg／mL 鏈霉素），置于 37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。HCT-8／5-FU細(xì)胞在上述培養(yǎng)條件下，同時在培養(yǎng)基中添加了15 μg／mL的5-FU，以維持其耐藥性。

2.3 RT-PCR法檢測HCT-8和HCT-8／5-FU細(xì)胞中 linc01843的表達(dá) 將 HCT-8和 HCT-8／5-FU細(xì)胞按2×105個／孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入 5-FU（HCT-8：0、400 μmonl／L 5-FU；HCT-8／5-FU：0、3 200 μmonl／L 5-FU）干預(yù)48 h。48 h后，使用Trizol試劑提取總RNA。利用HiScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；用 ChamQTM SYBR qPCR預(yù)混液以及l(fā)inc01843的引物，從cDNA中擴(kuò)增出linc01843，將GAPDH作為內(nèi)參。相對linc01843的RNA表達(dá)分析使用 2-ΔΔCt方法。

2.4 轉(zhuǎn)染 linc01843到 HCT-8和 HCT-8／5-FU細(xì)胞中 分別用Opti-MEN培養(yǎng)基配置si-linc01843、negative control（陰性對照）和 lipofectamine 3000 試劑液，且si-linc01843和negative control的終濃度為30 nmol／L，室溫靜止 5 min。 將配置好 si-linc01843、negative control與lipofectamine 3000試劑液等體積混合，室溫靜止15 min后加入到親本HCT-8細(xì)胞和5-FU耐藥HCT-8／5-FU細(xì)胞中。6 h后，去掉上清液，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基，進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.5 RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染si-linc01843后的HCT-8和HCT-8／5-FU細(xì)胞中l(wèi)inc01843的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染 si-linc01843、negative control的 HCT-8 和 HCT-8／5-FU細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，使用Trizol試劑提取總RNA。利用HiScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；用 ChamQTM SYBR qPCR預(yù)混液以及l(fā)inc01843的引物，從cDNA中擴(kuò)增出linc01843，將GAPDH作為內(nèi)參。相對linc01843的RNA 表達(dá)分析使用 2-ΔΔCt方法。

2.6 MTT法檢測5-FU對轉(zhuǎn)染si-linc01843后的HCT-8和HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，將 HCT-8、HCT-8／5-FU細(xì)胞按1×104個／孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，利用 lipofectamine 3000 將 si-linc01843、negative control轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，6 h后換液，分別加入不同劑量的 5-FU（HCT-8：0、200、400、800 μmonl／L 5-FU；HCT-8／5-FU：0、1 600、3 200、6 400 μmonl／L 5-FU），干預(yù)48 h后移去上清液，每孔加入0.5 mg／mL MTT溶液100 μL，37℃培養(yǎng)4 h。棄上清液后，每孔加入 100 μL DMSO，振蕩 10 min后，在 570 nm 處測OD值。

2.7 MTT法檢測ECSB及5-FU對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，將HCT-8／5-FU細(xì)胞按1×104個／孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入 ECSB（0、50、100、150、200、250 μg／mL）或 5-FU（0、400、800、1 600、3 200、6 400μmol／L）或 ECSB 聯(lián)合 5-FU（400、800、1 600、3 200、6 400 μmol／L 5-FU＋50 μg／mL ECSB；400、800、1 600、3 200、6 400 μmol／L 5-FU＋100 μg／mL ECSB）干預(yù)48 h，48 h后移去上清液，每孔加入 0.5 mg／mL MTT溶液100 μL，37℃培養(yǎng)4 h。棄上清液后，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，在570 nm處測OD值。

2.8 RT-PCR法檢測ECSB對 HCT-8／5-FU細(xì)胞中l(wèi)inc01843表達(dá)的影響 將HCT-8／5-FU細(xì)胞按2×105個／孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入 0、3 200 μmol／L 5-FU，3 200 μmol／L 5-FU＋50 μg／mL ECSB，3 200 μmol／L 5-FU＋100 μg／mL ECSB 干預(yù) 48 h，48 h 后收集各組細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA。利用HiScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；用ChamQTM SYBR qPCR預(yù)混液以及l(fā)inc01843的引物，從cDNA中擴(kuò)增出linc01843，將GAPDH作為內(nèi)參。相對linc01843的RNA表達(dá)分析使用2-ΔΔCt方法。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間統(tǒng)計分析采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 linc01843在 HCT-8和 HCT-8／5-FU細(xì)胞中的表達(dá) 本研究發(fā)現(xiàn)：在5-FU干預(yù)下，HCT-8和HCT-8／5-FU細(xì)胞中的linc01843表達(dá)均顯著高于各自的對照組（見圖1），提示linc01843可能與大腸癌對5-FU的耐藥有關(guān)。

3.2 linc01843參與大腸癌5-FU的耐藥 在轉(zhuǎn)染了si-linc01843后，HCT-8和HCT-8／5-FU細(xì)胞中l(wèi)inc01843表達(dá)均顯著低于各自的negative control組（見圖2），說明轉(zhuǎn)染si-linc01843到兩株細(xì)胞中的模型構(gòu)建成功，可進(jìn)行后續(xù)實驗。表1和表2結(jié)果顯示：在沒有5-FU干預(yù)下，轉(zhuǎn)染了si-linc01843的HCT-8細(xì)胞和HCT-8／5-FU細(xì)胞活力已顯著低于其各自的negative control組，在相同5-FU劑量干預(yù)48 h下，轉(zhuǎn)染了si-linc01843組的兩株細(xì)胞活力仍均顯著低于各自的negative control組。這些實驗結(jié)果表明：linc01843參與了大腸癌5-FU的耐藥。

圖1 HCT-8和HCT-8／5-FU細(xì)胞在5-FU干預(yù)下的linc01843表達(dá)

圖2 HCT-8和HCT-8／5-FU細(xì)胞在轉(zhuǎn)染si-linc01843及negative control后的linc01843表達(dá)

表1 linc01843對HCT-8細(xì)胞活力的影響（±s）%

表1 linc01843對HCT-8細(xì)胞活力的影響（±s）%

注：與 0 μmol／L 5-FU 組比較，1） P＜0.05；與 negative control組比較，2） P＜0.05。

5-F U（μ m o l／L）0 2 0 0 4 0 0 8 0 0 n 6 6 6 6 n e g a t i v e c o n t r o l組1 0 0.0 0±4.4 3 6 4.5 9±3.3 5 1）6 0.2 2±2.8 5 1）5 8.7 9±3.1 2 1）s i-l i n c 0 1 8 4 3組7 8.5 9±2.4 6 2）5 4.9 2±4.8 0 2）5 3.1 9±2.2 0 2）4 6.5 0±2.4 1 2）

3.3 ECSB及5-FU對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響 表3結(jié)果顯示：HCT-8／5-FU細(xì)胞在ECSB干預(yù)48 h后，其細(xì)胞活力呈劑量依賴性下降。為進(jìn)一步研究ECSB能否逆轉(zhuǎn)HCT-8／5-FU細(xì)胞對5-FU的耐藥性，采用 50和 100 μg／mL ECSB和不同劑量的5-FU聯(lián)合給藥干預(yù)HCT-8／5-FU細(xì)胞48 h，與單獨5-FU給藥組相比，ECSB聯(lián)合5-FU給藥能夠更加顯著抑制HCT-8／5-FU細(xì)胞的活力，見表4。以上研究結(jié)果證實，ECSB能夠逆轉(zhuǎn)HCT-8／5-FU對5-FU的耐藥性。

3.4 ECSB對 HCT-8／5-FU細(xì)胞中l(wèi)inc01843表達(dá)的影響 圖3顯示：在5-FU干預(yù)下，HCT-8／5-FU細(xì)胞中的linc01843表達(dá)顯著高于對照組。而在5-FU和ECSB聯(lián)合干預(yù)下，HCT-8／5-FU細(xì)胞中的linc01843表達(dá)則顯著低于單獨5-FU給藥組。該實驗結(jié)果表明：ECSB逆轉(zhuǎn)大腸癌5-FU耐藥的作用機(jī)制之一是通過調(diào)控linc01843的表達(dá)。

表2 linc01843對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響（±s）%

表2 linc01843對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響（±s）%

注：與 0 μmol／L 5-FU 組比較，1） P＜0.05；與 negative control組比較，2） P＜0.05。

5-F U（μ m o l／L）0 1 6 0 0 3 2 0 0 6 4 0 0 n 6 6 6 6 n e g a t i v e c o n t r o l組1 0 0.0 0±7.7 0 8 3.4 6±5.7 0 1）7 4.6 7±5.1 7 1）6 6.4 5±6.5 9 1）s i-l i n c 0 1 8 4 3組8 9.2 5±5.5 6 2）7 4.0 9±2.9 9 2）6 6.1 1±2.5 0 2）5 4.9 2±3.7 1 2）

表3 ECSB對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響（±s）%

表3 ECSB對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響（±s）%

注：與 0 μg／mL ECSB 組比較，1） P＜0.05。

E C S B／（μ g／m L）0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 n 6 6 6 6 6 6細(xì)胞活力1 0 0.0 0±1.5 1 8 6.8 4±6.3 3 1）6 1.1 3±3.4 1 1）4 1.9 2±2.7 9 1）3 2.5 2±0.7 7 1）2 9.1 5±2.0 0 1）

表4 ECSB聯(lián)合5-FU對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響（±s）%

表4 ECSB聯(lián)合5-FU對HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響（±s）%

注：與 0 μmol／L 5-FU 組比較，1） P＜0.05；分別與 400、800、1 600、3 200、6 400 μmol／L 5-FU 組比較，2） P＜0.05。

5-F U／（μ m o l／L）0 4 0 0 8 0 0 1 6 0 0 3 2 0 0 6 4 0 0 n 6 6 6 6 6 6 E C S B／（μ g／m L）0 1 0 0.0 0±2.3 7 8 4.3 1±5.1 0 1）8 1.1 3±2.7 5 1）7 6.1 7±1.3 6 1）7 4.4 4±1.8 9 1）7 1.7 4±2.0 8 1）5 0—7 7.6 2±4.4 5 2）7 2.7 4±5.7 8 2）7 1.1 8±2.5 0 2）6 4.4 6±6.1 3 2）6 3.2 1±2.2 0 2）1 0 0—5 1.1 7±5.5 4 2）4 9.6 9±1.2 4 2）5 1.4 5±1.6 9 2）4 8.3 3±2.3 0 2）4 6.7 9±1.9 1 2）

圖3 ECSB對HCT-8／5-FU細(xì)胞中l(wèi)inc01843表達(dá)的影響

4 討論

腫瘤耐藥是指腫瘤細(xì)胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，同時對其他與之化學(xué)結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制完全不同的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥［14］。目前，腫瘤耐藥的作用機(jī)制非常復(fù)雜，涉及到藥物轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的異常表達(dá)、細(xì)胞增殖、凋亡以及上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化紊亂等［15］?，F(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以通過調(diào)控相關(guān)信號通路，引起腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化等改變，或直接調(diào)控藥物轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白，從而對腫瘤細(xì)胞的耐藥產(chǎn)生影響。如過表達(dá)lncRNA HOTTIP能夠激活 Wnt／β-catenin信號通路，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)入S期，增加其對順鉑的耐藥性［16］。lncRNA H19通過靶向激活生存信號通路中的關(guān)鍵蛋白AKT，從而促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤對長春新堿的耐藥性［17］。LncRNA CHRF在卵巢癌順鉑耐藥中的新作用是由miR-10b誘導(dǎo)的EMT和STAT3信號介導(dǎo)的［18］。LncRNA MRUL通過促進(jìn)藥物轉(zhuǎn)運蛋白ABCB1的表達(dá)，導(dǎo)致化療藥物外排增加，使得胃癌細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤耐藥現(xiàn)象［19］。

Linc01843是一種lincRNA（long intergenic noncoding RNA），也被命名為 lncRNA AC005355.2，位于 chr5：134506552-134509229：+。 目前，linc01843在腫瘤研究方面的報道較少。本研究首次發(fā)現(xiàn)linc01843在5-FU干預(yù)后的HCT-8和 HCT-8／5-FU細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)，提示其可能和5-FU干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞有關(guān)。在兩株細(xì)胞中同時敲低linc01843，發(fā)現(xiàn)敲低linc01843后均能增強(qiáng)兩株細(xì)胞對5-FU的敏感性，初步證實其參與了5-FU耐藥的過程。

隨著國家對中藥研發(fā)的重視，中藥聯(lián)合化療藥物治療腫瘤受到人們的廣泛關(guān)注。臨床研究顯示，兩者聯(lián)合用藥，可減輕化療藥物產(chǎn)生的毒副作用，并降低化療藥物產(chǎn)生的交叉耐藥，同時提高患者的治愈率［20］。先前已有大量文獻(xiàn)顯示，中藥能夠通過調(diào)控lncRNA的表達(dá)逆轉(zhuǎn)多種腫瘤對化療藥物的耐藥性［5］。半枝蓮是一種傳統(tǒng)中草藥，在臨床以及基礎(chǔ)實驗均已證明，其能起到良好的抗癌療效［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，對5-FU存在顯著耐藥性的HCT-8／5-FU細(xì)胞，對ECSB不存在耐藥性。ECSB聯(lián)合5-FU干預(yù)HCT-8／5-FU細(xì)胞，可以顯著逆轉(zhuǎn) HCT-8／5-FU細(xì)胞對5-FU的耐藥性。并且，初步研究也發(fā)現(xiàn)，在HCT-8／5-FU 細(xì)胞中，5-FU 干預(yù)后，linc01843的表達(dá)顯著上升，而ECSB聯(lián)合5-FU干預(yù)后，可顯著下調(diào)linc01843的表達(dá)。說明ECSB逆轉(zhuǎn)大腸癌5-FU耐藥的作用機(jī)制之一是通過調(diào)控linc01843的表達(dá)。由于耐藥機(jī)制極其復(fù)雜，關(guān)于linc01843后續(xù)的功能以及深入的機(jī)制研究，以及半枝蓮調(diào)控linc01843的表達(dá)后級聯(lián)作用于下游的哪些效應(yīng)蛋白而最終發(fā)揮功效，還有待進(jìn)一步的探討。