雷周滿，菅書(shū)明，馮東升

（許昌市中心醫(yī)院普外科，河南 許昌 461000）

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第2大原因［1］。胃癌的治療方法包括手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療等，其中根治性手術(shù)是最有效的治療方法，但晚期胃癌多已發(fā)生侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)時(shí)期，導(dǎo)致患者5 a生存率較低［2］。因此，深入了解胃癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制并探索新的治療靶點(diǎn)是臨床治療胃癌的當(dāng)務(wù)之急。微RNA（microRNA，miRNA）是由18～25個(gè)核苷酸組成的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其可通過(guò)結(jié)合靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)發(fā)揮作用，導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯。異常表達(dá)的miRNA可通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［3-4］。miR-139-5p是一種潛在的調(diào)節(jié)性miRNA，在膀胱癌、卵巢癌和肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌因子的作用［5-7］。有研究顯示，miR-139-5p在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于相應(yīng)的癌旁組織，且與胃癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［8］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，已有研究顯示，其與鼻咽癌、卵巢癌和骨肉瘤等的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［9-12］。目前，miR-139-5p對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響鮮有報(bào)道。本研究旨在探討miR-139-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，以期為胃癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器永生化人胃黏膜上皮細(xì)胞GES1及人胃癌細(xì)胞SGC-7901、AGS和BGC-823購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；PRIM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青-鏈霉素雙抗購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，cDNA第1鏈合成試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，miR-139-5p mimics和陰性對(duì)照質(zhì)粒均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitogen公司，實(shí)驗(yàn)所用引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成，鼠抗人Wnt3a、β-catenin、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）和內(nèi)參磷酸甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，山羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Coring公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，Bio-Best-140E凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)SIM公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES1和胃癌細(xì)胞SGC-7901、AGS和BGC-823均培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的PRIM-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液中含1×106U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素，將細(xì)胞置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，并將相對(duì)濕度設(shè)置為95%。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，1～2 d更換1次培養(yǎng)液，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞轉(zhuǎn)染收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞，胰蛋白酶消化，接種于6孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至融合度達(dá)50%～60%時(shí)將細(xì)胞分為miR-139-5p mimics組、miR-NC組和空白對(duì)照組，按脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)分別將miR-139-5p mimics（上游引物序列為5′-TCTACAGTGCACGTGTC-3′，下游引物序列為5′-GAATACCTCGGACCCTGC-3′）、陰性對(duì)照質(zhì)粒（上游引物序列為5′-CAGCCTGTCCACACAAAAGC-3′，下游引物系列為5′-CCATCGATTTGGGGGTTCCA-3′）轉(zhuǎn)染至miR-139-5pmimics組和miR-NC組SGC-7901細(xì)胞，空白對(duì)照組細(xì)胞不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后將各組SGC-7901細(xì)胞置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞和胃黏膜細(xì)胞中miR-139-5p的表達(dá)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES1、SGC-7901、AGS、BGC-823細(xì)胞及轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細(xì)胞，分別使用RNA提取試劑盒抽提各細(xì)胞中總RNA。使用微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定RNA的純度和濃度，取合格的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，以U6為內(nèi)參，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量。miR-139-5p正向引物序列為5′-GCCTCTACAGTGCACGTGTCTC-3′；反向引物序列為5′-CGCTGTTCTCATCTGTCTCGC-3′。U6正向引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；反向引物序列為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)結(jié)束后獲取目的基因和內(nèi)參基因的Ct，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin 和 cyclin D1 蛋白相對(duì)表達(dá)量收集轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細(xì)胞，加入500μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液，裂解30 min后離心，收集上清液，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白樣品濃度，向蛋白中加入適量上樣緩沖液，加熱變性。在每個(gè)泳道孔中加入30μg變性蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白分離后經(jīng)濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，將膜浸入含50 g·L-1脫脂牛奶的封閉液中孵育1 h，洗膜后加入一抗（Wnt3a、β-catenin和cyclin D1的一抗稀釋比例分別為1∶800、1∶800、1∶800），4℃孵育過(guò)夜，洗膜后再加入稀釋比例為1∶300的二抗，室溫孵育2 h，采用ECL法曝光條帶。使用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞活力收集轉(zhuǎn)染24 h后的各組SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，置于恒溫箱中孵育，分別于孵育24、48、72、96 h時(shí)于檢測(cè)孔中加入20μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，然后去除上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜，震蕩5 min，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的吸光度值。吸光度值越大，代表細(xì)胞活力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞侵襲能力將無(wú)血清培養(yǎng)液加入到Transwell小室的上室，置于培養(yǎng)箱中孵育，將轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細(xì)胞以無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌3次，并調(diào)整為1×108L-1細(xì)胞懸液，取100μL細(xì)胞懸液接種至Transwell小室的上室，下室加入500μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于常規(guī)培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，擦去上室未穿膜的細(xì)胞，多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察并計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞和胃黏膜上皮細(xì)胞中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量比較胃癌細(xì)胞SGC-7901、AGS、BGC-823和胃黏膜上皮細(xì)胞GES1中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量分別為0.15±0.02、0.62±0.06、0.50±0.05、1.24±0.14；SGC-7901、AGS和BGC-823細(xì)胞中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量顯著低于GES1細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.625、10.625、12.412，P＜0.05）；SGC-7901細(xì)胞中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量顯著低于AGS、BGC-823細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.021、11.847，P＜0.05）；AGS與BGC-823細(xì)胞中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.021，P＞0.05）。

2.2 3組SGC-7901細(xì)胞中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量比較空白對(duì)照組、miR-NC組和miR-139-5p mimics組SGC-7901細(xì)胞中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量分別為1.05±0.10、0.96±0.07、2.01±0.23；miR-139-5p mimics組SGC-7901細(xì)胞中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和miR-NC組（t=6.644、6.942，P＜0.05）；空白對(duì)照組與miR-NC組細(xì)胞中miR-139-5p相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.571，P＞0.05）。

2.3 3組SGC-7901細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin和cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。miR-139-5p mimics組SGC-7901細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin和cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（miR-139-5p mimics組與空白對(duì)照組比較：t=12.032、15.320、14.320，P＜0.05；miR-139-5p mimics組與miR-NC組比較：t=12.651、14.210、15.201，P＜0.05）；空白對(duì)照組與miR-NC組SGC-7901細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin和cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.014、2.352、1.021，P＞0.05）。

圖1 3組SGC-7901細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin和cyclin D1蛋白表達(dá)（Western blot）Fig.1 Expression of Wnt3a，β-catenin and cyclin D1 protein in SGC-7901 cells in the three groups（Western blot）

表1 3組SGC-7901細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin和cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.1 Comparison of the relative expression of Wnt3a，β-catenin and cyclin D1 protein in SGC-7901 cells among the three groups （±s）

表1 3組SGC-7901細(xì)胞中Wnt3a、β-catenin和cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.1 Comparison of the relative expression of Wnt3a，β-catenin and cyclin D1 protein in SGC-7901 cells among the three groups （±s）

注：與空白對(duì)照組和miR-NC組比較a P＜0.05。

組別 n Wnt3a蛋白 β-catenin蛋白 cyclin D1蛋白空白對(duì)照組3 0.72±0.15 0.89±0.12 0.92±0.10 miR-NC組 3 0.75±0.13 0.90±0.14 0.90±0.11 miR-139-5p mimics組 3 0.05±0.01a 0.10±0.02a 0.08±0.02a F 26.302 35.320 39.241 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 3組SGC-7901細(xì)胞活力的比較結(jié)果見(jiàn)表2。轉(zhuǎn)染后24、48 h，空白對(duì)照組、miR-NC組和miR-139-5p mimics組SGC-7901細(xì)胞活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；轉(zhuǎn)染后72、96 h時(shí)，miR-139-5p mimics組SGC-7901細(xì)胞活力顯著低于空白對(duì)照組和miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染后72、96 h，空白對(duì)照組與miR-NC組SGC-7901細(xì)胞活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 3組SGC-7901細(xì)胞活力比較Tab.2 Comparison of SGC-7901 cell viability among the three groups （±s）

表2 3組SGC-7901細(xì)胞活力比較Tab.2 Comparison of SGC-7901 cell viability among the three groups （±s）

注：與空白對(duì)照組和miR-NC組比較a P＜0.05。

組別 n SGC-7901細(xì)胞活力（吸光度）24 h 48 h 72 h 96 h空白對(duì)照組3 0.32±0.03 0.50±0.03 0.75±0.05 0.98±0.05 miR-NC組 3 0.36±0.03 0.52±0.04 0.74±0.05 0.95±0.06 miR-139-5p mimics組 3 0.34±0.02 0.43±0.03 0.59±0.04a 0.72±0.05a F 1.205 1.062 4.320 6.201 P ＞0.05 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.5 3組SGC-7901細(xì)胞侵襲能力的比較結(jié)果見(jiàn)圖2?？瞻讓?duì)照組、miR-NC組和miR-139-5p mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為98.67±10.26、101.45±8.24、49.33±5.12；miR-139-5p mimics組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于空白對(duì)照組和miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.7.447、13.751，P＜0.05）；空白對(duì)照組與miR-NC組穿膜細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.367，P＞0.05）。

圖2 3組SGC-7901細(xì)胞侵襲能力（Transwell實(shí)驗(yàn)）Fig.2 Invasion of SGC-7901 cells in the three groups（Transwell experiment）

3 討論

胃癌為中國(guó)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，也是手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療失敗的主要原因［13-14］。因此，探討胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。近年來(lái)，miR在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及腫瘤診斷和治療等方面受到極大關(guān)注［15］。在腫瘤形成過(guò)程中，miR可能發(fā)揮癌基因或腫瘤抑制因子的作用。miR-139-5p首次在神經(jīng)變性疾病中被發(fā)現(xiàn)，并且表達(dá)下調(diào)［16］。隨后，miR-139-5p被確定為癌癥診斷、療效和預(yù)后評(píng)估中常用的生物標(biāo)志物之一［17］。HUA等［18］研究顯示，miR-139-5p通過(guò)與重組人E26轉(zhuǎn)錄因子1相互作用抑制肝細(xì)胞癌中有氧糖酵解及細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。SHI等［19］研究顯示，miR-139-5p可通過(guò)調(diào)節(jié)DNMT1基因抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。LIU等［20］研究指出，miR-139-5p靶向HOXA10轉(zhuǎn)錄物并抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，表明miR-139-5p在人子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制中起腫瘤抑制作用。但miR-139-5p在胃癌中的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，miR-139-5p在3株胃癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著低于永生化胃黏膜上皮細(xì)胞，提示miR-139-5p可能作為抑癌因子在胃癌中發(fā)揮作用。

為進(jìn)一步探究miR-139-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及可能的作用機(jī)制，本研究在miR-139-5p基礎(chǔ)表達(dá)量最低的胃癌細(xì)胞SGC-7901中轉(zhuǎn)染miR-139-5p mimics質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p mimics組SGC-7901細(xì)胞活力顯著低于空白對(duì)照組和miR-NC組。LI等［21］研究顯示，miR-139-5p可抑制肝細(xì)胞癌的增殖，與本研究結(jié)果相符。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-139-5p高表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，表明miR-139-5p能夠明顯抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞多能性和細(xì)胞惡變過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與人類多種腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)［22-24］。有研究顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和分化相關(guān)，影響成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的活性［25］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在乳腺癌中的異常激活可增強(qiáng)c-myc和cyclin D1的轉(zhuǎn)錄，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用［26］，而阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路的傳導(dǎo)可降低乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力［27］。本研究結(jié)果顯示，miR-139-5p過(guò)表達(dá)可下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白Wnt3a、β-catenin和cyclin D1的表達(dá)，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的傳導(dǎo)。

綜上所述，miR-139-5p可顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖和侵襲，其作用機(jī)制可能與阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān)，miR-139-5p有望成為胃癌治療的新作用靶點(diǎn)。