吳 芳，郭 俊，李 蓓，齊紅艷

（1.西安市兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710000；2.唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710000）

結(jié)核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病中最常見(jiàn)的一種，是由結(jié)核分枝桿菌侵入蛛網(wǎng)膜下腔，隨腦脊液擴(kuò)散，引起腦膜、腦實(shí)質(zhì)及脊髓非特異性炎癥反應(yīng)的疾病，病死率高達(dá)20%～25%［1-2］。由于患者機(jī)體環(huán)境、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用等因素［3-4］，臨床上對(duì)TBM的治療效果不佳，因此，需要研究TBM的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供思路。微RNA（microRNA，miR）在轉(zhuǎn)錄后通過(guò)調(diào)節(jié)特定信使RNA（messenger RNA，mRNA）的翻譯來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)［5］，并參與調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程［6-7］。研究表明，miR-708-5p在人和小鼠中具有高度同源性，且在TBM等多種疾病中表達(dá)升高［8-9］，但miR-708-5p在TBM中的作用和分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過(guò)小鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)探究miR-708-5p對(duì)TBM的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株及細(xì)胞6周齡健康雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量21～33（27.40±3.62）g，由陜西省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠在12 h晝夜節(jié)律下分籠飼養(yǎng)，室溫18～25℃，空氣濕度45%～65%，保證小鼠自由飲食與運(yùn)動(dòng)。結(jié)核分枝桿菌H37Rv（ATCC27294）和小鼠腦膜細(xì)胞GIBH001購(gòu)自美國(guó)Type Culture Collection公司。

1.2 主要試劑與儀器RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，伊文思藍(lán)溶液、Tris緩沖生理鹽水（Tris-buffered saline and Tween-20，TBST）購(gòu)自上海阿拉丁生物科技有限公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，TRIzol試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程公司，放射免疫沉淀測(cè)定（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液購(gòu)自上海碧云天生物有限公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemical luminescence，ECL）試劑購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；miR-708-5p mimic、miR-708-5p inhibitor及其相應(yīng)的對(duì)照物NC-mimic、NC-inhibitor購(gòu)自廣州日博生物有限公司，補(bǔ)體C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白1（complement C1q tumor necrosis factor-related protein 1，C1qtnf1）過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及其對(duì)照物Vector購(gòu)自美國(guó)Addgene公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，鼠抗兔多克隆磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3 kinase，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；微量注射器購(gòu)自北京友成嘉業(yè)生物科技陰限公司，電子分析天平購(gòu)自貝士德儀器科技（北京）有限公司，Spectronix 3000紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction，qRTPCR）儀購(gòu)自日本Bio-Rad公司，凝膠成像分析儀購(gòu)自廣州瑞豐實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及TBM 小鼠模型制備應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將48只小鼠分為假手術(shù)組、TBM 組、TBM+miR-708-5p inhibitor組及TBM+NC-inhibitor組，每組12只。小鼠經(jīng)腹腔注射0.1 mg·L-1的水合氯醛（3 mL·kg-1）進(jìn)行麻醉。TBM 組、TBM+miR-708-5p inhibitor組及TBM+NC-inhibitor組小鼠經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL的結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌懸液（2.5×109CFU·L-1）制備TBM模型，假手術(shù)組小鼠給予等體積的PBS。造模成功后，miR-708-5p inhibitor組、TBM+NC-inhibitor組小鼠分別經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL miR-708-5p inhibitor（2 mg·kg-1）、NC-inhibitor（2 mg·kg-1），每2 d注射1次，連續(xù)1周。

1.3.2 小鼠腦組織取材4組小鼠經(jīng)尾靜脈注射伊文思藍(lán)溶液（4 mL·kg-1），循環(huán)1 h后，主動(dòng)脈灌注50 mL冰冷的PBS，脊椎脫臼法處死各組小鼠，剪開(kāi)頭顱部位皮膚漏出顱骨，用鑷子從下向上逐步去除小鼠顱骨，當(dāng)全腦露出時(shí)，小心用眼科鑷去除腦膜和血管，獲得小鼠腦組織。獲取小鼠腦組織后，一部分腦組織立即采用干濕法檢測(cè)腦組織含水量，另一部分腦組織于-80℃冷凍保存待用。

1.3.3 干濕法檢測(cè)各組小鼠腦組織含水量取4組小鼠腦組織并分為同側(cè)和對(duì)側(cè)皮層、同側(cè)和對(duì)側(cè)基底神經(jīng)節(jié)及小腦5個(gè)部分，并立即稱濕質(zhì)量（wet weight，WW），待各部位腦組織干燥24 h后測(cè)量干質(zhì)量（dry weight，DW）。各組小鼠腦組織含水量=（WW-DW）/WW×100%。

1.3.4 伊文思藍(lán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠血腦屏障通透性取4組凍存的小鼠腦組織在PBS中均漿，4℃、12 000 r·min-1離 心30 min，收集上清液。每500 mL上清液中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)50%三氯乙酸，4℃孵育過(guò)夜后，4℃、12 000 r·min-1離心30 min，采用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)610 nm處測(cè)定伊文思藍(lán)的吸光度值。根據(jù)不同濃度伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組小鼠腦組織中伊文思藍(lán)滲出量（以伊文思藍(lán)滲出量表示小鼠血腦屏障通透性）。

1.3.5 ELISA法檢測(cè)各組小鼠腦組織中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平取4組凍存的小鼠腦組織進(jìn)行勻漿，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和待檢測(cè)的各組腦組織樣品分別加入被一抗包被好的96孔板中，嚴(yán)格按照TNF-α和IL-1β的ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組待測(cè)樣品中TNF-α和IL-1β的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.6 qRT-PCR 法檢測(cè)各組小鼠腦組織中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用TRIzol試劑提取4組凍存的小鼠腦組織的總RNA，提取方法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），并進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件為：95℃10 min；95℃30 s，60℃60 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-708-5p上游引物序列為5′-GGCGCGCAAGGAGCTTACAATC-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；C1qtnf1上游引物序列為5′-TTGGTGGCTTCTGCTGGTTATGG-3′，下游引物序列為5′-TGTCCTGGTTCTCCTGCGTCTC-3′；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列為5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物序列為5′-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組小鼠腦組織中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染將GIBH001細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中，使用含100 U· mL-1青霉素、100 mg· L-1鏈霉素和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GIBH001細(xì)胞，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染載體的不同，將細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-708-5p過(guò)表達(dá)組、C1qtnf1過(guò)表達(dá)組及miR-708-5p+C1qtnf1過(guò)表達(dá)組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別轉(zhuǎn)染NC-mimic和Vector、miR-708-5p mimic和 Vector、NC-mimic和pcDNA-C1qtnf1、miR-708-5p mimic和pcDNA-C1qtnf1。另根據(jù)轉(zhuǎn)染載體的不同，將細(xì)胞分為空白組、NC-inhibitor組及miR-708-5p inhibitor組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M細(xì)胞不做處理，NC-inhibitor組、miR-708-5p inhibitor組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC-inhibitor、miR-708-5p inhibitor。轉(zhuǎn)染操作按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)6 h，更換含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 Western blot法檢測(cè)各組小鼠腦組織和GIBH001細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量取4組凍存的小鼠腦組織以及轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的各組GIBAH001細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取腦組織和細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。取15μL蛋白上樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，使用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，在體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶中封閉1 h后，用TBST漂洗3次，每次5 min，隨后分別加入PI3K（1∶500）、p-PI3K（1∶500）、Akt（1∶500）、p-Akt（1∶500）一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶400），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL試劑顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用全自動(dòng)凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照和定量分析，以待測(cè)目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt。

1.3.9 qRT-PCR 法檢測(cè) GIBH001細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，根據(jù)TRIzol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA。取3μg總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明獲取cDNA，并進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR 反應(yīng)條件、C1qtnf1和內(nèi)參GAPDH的引物序列及相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算方法同“1.3.6”。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠腦組織含水量比較結(jié)果見(jiàn)表1。TBM組小鼠腦組織同側(cè)基底神經(jīng)節(jié)含水量顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBM+miR-708-5p inhibitor組小鼠腦組織同側(cè)基底神經(jīng)節(jié)含水量顯著低于TBM+NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBM 組和TBM+NCinhibitor組小鼠腦組織同側(cè)基底神經(jīng)節(jié)含水量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4組小鼠對(duì)側(cè)皮質(zhì)、對(duì)側(cè)基底神經(jīng)節(jié)、同側(cè)皮質(zhì)及小腦含水量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 4組小鼠腦組織含水量比較Tab.1 Comparison of water content in brain tissue of mice among the four groups ±s）

表1 4組小鼠腦組織含水量比較Tab.1 Comparison of water content in brain tissue of mice among the four groups ±s）

注：與假手術(shù)組比較a P＜0.05；與TBM+NC-inhibitor組比較b P＜0.05。

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2.2 4組小鼠血腦屏障通透性比較假手術(shù)組、TBM組及TBM+NC-inhibitor組及TBM+miR-708-5p inhibitor組小鼠伊文思藍(lán)滲出量分別為（1.00±0.27）、（4.95±0.33）、（5.12±0.29）、（1.12±0.35）μg·g-1。TBM組小鼠血腦屏障通透性顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBM+miR-708-5p inhibitor組小鼠血腦屏障通透性顯著低于TBM+NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBM組與TBM+NC-inhibitor組小鼠血腦屏障通透性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 4組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β水平比較結(jié)果見(jiàn)表2。TBM組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β水平高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBM+miR-708-5p inhibitor組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β水平顯著低于TBM+NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBM 組與TBM+NCinhibitor組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 4組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β水平比較Tab.2 Comparison of the levels of TNF-αand IL-1βin brain tissues of mice among the four groups （±s）

表2 4組小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β水平比較Tab.2 Comparison of the levels of TNF-αand IL-1βin brain tissues of mice among the four groups （±s）

注：與假手術(shù)組比較a P＜0.05；與TBM+NC-inhibitor組比較b P＜0.05。

組別 n TNF-α/（ng·L-1） IL-1β/（ng·L-1）假手術(shù)組12 42.55±10.36 30.17±6.78 TBM組 12 203.56±14.67a 186.47±12.06a TBM+NC-inhibitor組 12 210.78±15.64 178.65±11.62 TBM+miR-708-5p inhibitor組 12 53.57±12.54b 43.12±11.63 b

2.4 4組小鼠腦組織中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)表3。與假手術(shù)組比較，TBM組小鼠腦組織中miR-708-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高，C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與TBM+NC-inhibitor組比較，TBM+miR-708-5p inhibitor組小鼠腦組織中miR-708-5p相對(duì)表達(dá)量降低，C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBM組與TBM+NC-inhibitor組小鼠腦組織中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 4組小鼠腦組織中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of the relative expression of miR-708-5p and C1qtnf1 mRNA in brain tissues of mice among the four groups （±s）

表3 4組小鼠腦組織中miR-708-5p和C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of the relative expression of miR-708-5p and C1qtnf1 mRNA in brain tissues of mice among the four groups （±s）

注：與假手術(shù)組比較a P＜0.05；與TBM+NC-inhibitor組比較b P＜0.05。

組別 n miR-708-5p C1qtnf1 mRNA假手術(shù)組12 1.00±0.09 0.99±0.09 TBM組 12 2.48±0.21a 0.29±0.10a TBM+NC-inhibitor組 12 2.40±0.20 0.28±0.09 TBM+miR-708-5p inhibitor組 12 1.05±0.11b 0.98±0.10 b

2.5 4組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較結(jié)果見(jiàn)圖1和表4。TBM組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBM+miR-708-5p inhibitor組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著低于TBM+NC-inhibitor組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TBM組和TBM+NC-inhibitor組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 4組小鼠腦組織中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表達(dá)（Western blot）Fig.1 Expression of PI3K，p-PI3K，Akt and p-Akt protein in brain tissues of mice in the four groups（Western blot）

表4 4組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較Tab.4 Comparison of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in brain tissues of mice among the four groups （±s）

表4 4組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較Tab.4 Comparison of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt in brain tissues of mice among the four groups （±s）

注：與假手術(shù)組比較a P＜0.05；與TBM+NC-inhibitor組比較b P＜0.05。

組別 n p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt假手術(shù)組12 1.02±0.16 1.02±0.15 TBM組 12 2.64±0.14a 2.46±0.13a TBM+NC-inhibitor組 12 2.52±0.20 2.57±0.22 TBM+miR-708-5p inhibitor組 12 1.05±0.17b 1.02±0.14 b

2.6 4組GIBH001細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較結(jié)果見(jiàn)圖2和表5。miR-708-5p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C1qtnf1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-708-5p+C1qtnf1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均顯著低于C1qtnf1過(guò)表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-708-5p+C1qtnf1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 4組GIBH001細(xì)胞中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表達(dá)（Western blot）Fig.2 Expression of PI3K，p-PI3K，Akt and p-Akt protein in GIBH001 cells in the four groups（Western blot）

表5 4組GIBH001細(xì)胞中PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt比較Tab.5 Comparison of PI3K/p-PI3K and Akt/p-Akt in GIBH001 cells among the four groups （±s）

表5 4組GIBH001細(xì)胞中PI3K/p-PI3K、Akt/p-Akt比較Tab.5 Comparison of PI3K/p-PI3K and Akt/p-Akt in GIBH001 cells among the four groups （±s）

注：與對(duì)照組比較a P＜0.05；與C1qtnf1過(guò)表達(dá)組比較b P＜0.05。

組別 n p-PI3K/PI3K p-Akt/Akt對(duì)照組12 1.01±0.05 1.00±0.12 miR-708-5p過(guò)表達(dá)組 12 2.44±0.13a 2.49±0.14a C1qtnf1過(guò)表達(dá)組 12 0.39±0.12a 0.32±0.11a miR-708-5p+C1qtnf1過(guò)表達(dá)組 12 0.98±0.09b 1.03±0.16 b

2.7 各組GIBH001細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較對(duì)照組、miR-708-5p過(guò)表達(dá)組、C1qtnf1過(guò)表達(dá)組、miR-708-5p+C1qtnf1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.03±0.14、0.31±0.12、2.48±0.10、1.04±0.09。miR-708-5p過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C1qtnf1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-708-5p+C1qtnf1過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于C1qtnf1過(guò)表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-708-5p+C1qtnf1過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

空白組、NC-inhibitor組、miR-708-5p inhibitor組細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.07、1.03±0.06、0.33±0.07。NC-inhibitor組細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。miR-708-5p inhibitor組細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-708-5p inhibitor組細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于NC-inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

miRNAs通過(guò)轉(zhuǎn)錄后階段來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)，且miRNAs的異常表達(dá)與許多疾病過(guò)程相關(guān)。miR-708-5p參與多種生理病理過(guò)程，如在肥胖及其相關(guān)疾病中，miR-708-5p是腎素血管緊張素系統(tǒng)的潛在靶點(diǎn)［10］；在心律失常心肌病小鼠模型中的致病作用［11］；在衰老和長(zhǎng)壽的關(guān)鍵通路中也占據(jù)重要位置［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，TBM組小鼠腦組織中miR-708-5p的相對(duì)表達(dá)量較假手術(shù)組顯著升高，提示miR-708-5p參與TBM的發(fā)生。

炎癥因子是由免疫原或其他刺激激活后合成、分泌的一類低分子質(zhì)量可溶性的生物活性物質(zhì)，在TBM發(fā)生后的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，可作為早期TBM的診斷依據(jù)［13-14］。本研究結(jié)果顯示，TBM組小鼠腦組織中TNF-α和IL-1β水平顯著高于假手術(shù)組，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符合［13-14］；而持續(xù)的炎癥反應(yīng)又會(huì)導(dǎo)致血腦屏障的破壞和腦水腫的擴(kuò)張，因此，TBM組小鼠腦組織中伊文思藍(lán)滲出量和同側(cè)基底神經(jīng)節(jié)含水量均顯著高于假手術(shù)組。而TBM+miR-708-5p inhibitor組小鼠腦組織中TNF-α 和IL-1β水平、伊文思藍(lán)滲出量、小鼠腦組織同側(cè)基底神經(jīng)節(jié)含水量較TBM+NC-inhibitor組顯著降低，說(shuō)明抑制miR-708-5p的表達(dá)可改善TBM小鼠的血腦屏障結(jié)構(gòu)、減輕腦水腫、抑制腦組織中TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。

miRNAs通過(guò)調(diào)控下游靶基因來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)功能。C1qtnf1是C1q/TNF相關(guān)蛋白家族的一員［15］。作為一種新型的脂肪因子，C1qtnf1在調(diào)節(jié)機(jī)體分泌、免疫以及心血管生理、病理方面發(fā)揮著重要的作用［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，TBM 組小鼠腦組織中C1qtnf1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于假手術(shù)組；miR-708-5p inhibitor組小鼠腦膜細(xì)胞中C1qtnf1 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于NC-inhibitor組；提示C1qtnf1在TBM 中同樣發(fā)揮著重要的作用，且miR-708-5p通過(guò)抑制C1qtnf1的表達(dá)參與小鼠腦損傷。

PI3K/Akt通路參與多種疾病的發(fā)展過(guò)程，腦組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究通過(guò)檢測(cè)p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)量來(lái)觀察PI3K/Akt通路是否參與TBM小鼠腦損傷，結(jié)果表明，TBM 組小鼠腦組織中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt水平顯著高于假手術(shù)組，提示PI3K/Akt通路可能參與TBM 的發(fā)生、發(fā)展；miR-708-5p過(guò)表達(dá)組小鼠腦膜細(xì)胞中p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt顯著高于對(duì)照組，提示miR-708-5p通過(guò)激活PI3K/Akt通路參與TBM小鼠腦損傷的過(guò)程。

綜上所述，抑制miR-708-5p的表達(dá)可有效緩解TBM小鼠的腦損傷，其具體作用機(jī)制為miR-708-5p通過(guò)調(diào)控C1qtnf1/PI3K/Akt軸來(lái)參與TBM誘導(dǎo)的小鼠腦損傷過(guò)程。本研究為尋找TBM潛在治療靶點(diǎn)奠定一定的基礎(chǔ)，但是本研究?jī)H從動(dòng)物和細(xì)胞水平驗(yàn)證了miR-708-5p的表達(dá)對(duì)TBM的影響，后續(xù)研究可考慮收集TBM患者的臨床資料進(jìn)行組織水平的研究，探討miR-708-5p的表達(dá)與TBM患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為TBM的預(yù)后及治療提供新的生物學(xué)標(biāo)記和靶點(diǎn)。