周 威，陳貢斌，劉海燕，郭銀謀，高田慧

（1.商丘市第一人民醫(yī)院腫瘤科，河南 商丘 476100；2.河南省人民醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450000）

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。盡管在過(guò)去的幾十年中，新的診斷和治療方法不斷發(fā)現(xiàn)，但每年仍有約180萬(wàn)人死于肺癌，其中85%的患者為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［2］。肺癌的常規(guī)治療方法以手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療和支持性護(hù)理（包括臨終護(hù)理）為主，多數(shù)患者的預(yù)后和生活質(zhì)量較差，術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率高，易產(chǎn)生多藥耐藥性，因此，需要開(kāi)發(fā)新的方法和藥物用于肺癌的治療和預(yù)防。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，植物來(lái)源的化合物具有潛在的抗癌活性［3］。黃芪為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，含有多種活性物質(zhì)，如多糖、皂苷、黃酮等，其中黃芪甲苷又稱為黃芪甲素IV（astragalosideⅣ，AS-Ⅳ），是黃芪主要的皂苷類有效活性成分，具有抗腫瘤、抗纖維化、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和代謝性疾病等作用［4-5］。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典途徑，在細(xì)胞增殖分化、人類器官發(fā)育和多種腫瘤的發(fā)生中起關(guān)鍵效應(yīng)［6］。Wnt-1、β-catenin是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，C-myc和細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是其下游信號(hào)通路的主要靶基因，在腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中扮演重要角色［7］。目前，已有研究證實(shí)，AS-Ⅳ在體內(nèi)和體外均對(duì)肺癌有抑制作用，但具體機(jī)制尚不清楚［8］。因此，本研究采用腹腔注射烏拉坦建立小鼠肺癌模型，通過(guò)觀察肺癌組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)來(lái)探討AS-Ⅳ對(duì)肺癌的預(yù)防與治療作用及其可能機(jī)制，以期為AS-Ⅳ的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物美國(guó)癌癥研究所小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22（20±2）g，6～8周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0011，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l件》要求。

1.2 主要試劑與儀器AS-Ⅳ（純度＞98%）購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字Z51020664），烏拉坦（純度＞99%）購(gòu)自北京化工廠（國(guó)藥準(zhǔn)字H37022259），蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色試劑盒、放射性免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、脫脂奶粉、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、蛋白Marker、TRIzol購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖 鏈 抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒及引物購(gòu)自日本Takara公司，Wnt-1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1、甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源單克隆抗體及羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，中性樹(shù)膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀購(gòu)自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司，AE223電子天平購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，MET VX200-T型渦旋振蕩器購(gòu)自施銳（上海）貿(mào)易有限公司，DW-86L626超低溫冰箱購(gòu)自海爾集團(tuán)，YA.ZD-10普通型電熱蒸餾水器購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠，RM2245切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司，7500型定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，G：BOX多功能凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Syngene公司，Multiskan MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，IX53顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司，TGL16MB高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與各組干預(yù)措施將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組，每組20只。對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其他4組小鼠腹腔注射烏拉坦溶液600 mg·kg-1制備肺癌模型，每周注射1次，持續(xù)10周［9］。

從造模當(dāng)天開(kāi)始，低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠分別灌胃給予AS-Ⅳ12.5、25.0、50.0 mg·kg-1，對(duì)照組和模型組小鼠灌胃等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)19周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組、模型組、低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組分別有19、16、17、17、18只存活小鼠。

1.3.2 生理指標(biāo)記錄與樣本采集從造模當(dāng)天開(kāi)始記錄各組小鼠體質(zhì)量、自主活動(dòng)次數(shù)（將小鼠放置于自主活動(dòng)記錄儀中，記錄5 min內(nèi)小鼠自主活動(dòng)次數(shù)），每2周1次。至第19周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠使用乙醚吸入麻醉后摘眼球取血，于4℃冰箱中靜置2 h，3 000 r·min-1（離心半徑為12.5 cm）離心10 min后取血清，分裝于EP管中，置于-80℃冰箱中保存。各組小鼠麻醉取血后脫臼處死，取肺組織置于冰上，生理鹽水清洗至無(wú)血絲，計(jì)算肺癌發(fā)生率（荷瘤小鼠數(shù)/檢測(cè)小鼠數(shù)×100%）和肺腫瘤數(shù)量（通過(guò)直接觀察并計(jì)數(shù)肺組織表面形成的腫瘤結(jié)節(jié)獲得），取平均值。各組小鼠一部分肺組織置于40 g·L-1多聚甲醛中固定，用于制作組織病理切片；一部分肺組織凍存于-80℃超低溫冰箱中用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）及Western blot法檢測(cè)肺組織中β-catenin、C-myc、Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)量。

1.3.3 HE染色觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)變化取各組小鼠肺組織，置于40 g·L-1多聚甲醛中固定48 h，清洗后置于不同濃度梯度乙醇中進(jìn)行梯度脫水，制作肺組織蠟塊，冰上預(yù)冷切片，切片厚度為4μm。組織切片置于載玻片上，應(yīng)用二甲苯脫蠟30 min，于不同濃度梯度乙醇溶液中復(fù)水，然后使用HE染液分別染細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，脫水后用中性樹(shù)膠封片，置于顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織水腫、細(xì)胞核增生、肺基本形態(tài)等病理變化情況。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125水平取各組待測(cè)血清加入到反應(yīng)孔中，每孔100μL，每組分別設(shè)4個(gè)復(fù)孔，37℃孵育90 min，棄掉孔內(nèi)液體，加入100μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60 min，棄掉孔內(nèi)液體，洗滌3次，加入100μL酶結(jié)合物工作液，37℃孵育30 min后棄掉孔內(nèi)液體，洗滌5次，每孔加入90μL底物溶液，37℃孵育15 min，加入50μL終止液，450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組小鼠血清中CEA、CA125水平。

1.3.5 qRT-PCR 法檢測(cè)各組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量稱取0.1 g小鼠肺組織，冰上研磨，加1 mL TRIzol裂解液提取總RNA，以總RNA為模版反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara公司設(shè)計(jì)合成。Wnt-1正向引物序列為5′-CTGCAGAGCATGGACTCGTC-3′，反向引物序列為5′-CCGTTGAAGAGAGTGGAGTG-3′，片段長(zhǎng)度247 bp；β-catenin正向引物序列為5′-TGCAGTTCGCCTTCACTATG-3′，反向引物序列為5′-ACTAGTCGTGGAATGGCACC-3′，片段長(zhǎng)度162 bp；C-myc正向引物序列為5′-ATGCCCCTCAACGTTAGC-3′，反向引物序列為5′-AGCTCGCTCTGCTGCTGC-3′，片段 長(zhǎng)度143 bp；Cyclin D1正向引物序列為5′-AACACATCATCCCCAAACAC-3′，反向引物序列為T(mén)CACACTTCATCACTCTGGA，片段長(zhǎng)度196 bp；GAPDH正向引物序列為5′-TGCTTCACCACCTTCTTGA-3′，反向引物序列為5′-TCACCATCTTCCAGGAGC-3′，片段長(zhǎng)度456 bp；所有樣品均以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系：三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）0.5μL，5×Buffer 2.5μL，Taq酶0.3μL，MgCl21.5μL，cDNA模板2.0μL，上下游引物各1.0μL，加去離子水至總體積為25.0μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；再次72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)各組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量取0.1 g小鼠肺組織剪碎后冰上研磨，3 000 r·min-1（離心半徑為12.5 cm）離心10 min，取沉淀，加入蛋白裂解液，提取肺組織蛋白，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h，隨后將條帶放入10 mL的Wnt-1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1兔源一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶1 000，4℃孵育12 h，第2天應(yīng)用加了吐溫的三子醇胺緩沖鹽水（tris buffered saline tween，TBST）清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗（1∶2 000），37℃孵育2 h，TBST清洗3次后滴加增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光液，反應(yīng)1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。內(nèi)參蛋白為GAPDH，使用Image J軟件分析各蛋白對(duì)應(yīng)的灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠體質(zhì)量和自主活動(dòng)次數(shù)比較結(jié)果見(jiàn)表1和表2。造模后第1周和第3周，5組小鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后第5周至第19周，模型組小鼠體質(zhì)量低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠體質(zhì)量分別從第5、7、11周開(kāi)始高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后第1周至第5周，低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模后第7周至第19周，低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組小鼠體質(zhì)量均從第7周開(kāi)始高于高劑量AS-Ⅳ組，第11周至19周低于高劑量AS-IV組，差異有統(tǒng)計(jì)數(shù)意義（P＞0.05）低劑量AS-Ⅳ組小鼠體質(zhì)量從第15周開(kāi)始低于AS-Ⅳ中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

造模后第1周和第3周，5組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后第5周至第19周，模型組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)顯著低于對(duì)照組，中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)從第11周開(kāi)始高于模型組，低劑量組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)從第13周開(kāi)始高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從第1周至第9周，低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組自主活動(dòng)次數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模后第11周至第19周，低劑量AS-Ⅳ組和中劑量AS-Ⅳ組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)分別從第11周和第13周開(kāi)始低于高劑量AS-Ⅳ組，低劑量AS-Ⅳ組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)從第11周開(kāi)始低于中劑量AS-IV組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 5組小鼠體質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of body weight of mice among the five groups （±s）

表1 5組小鼠體質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of body weight of mice among the five groups （±s）

注：與對(duì)照組比較a P＜0.05；與模型組比較b P＜0.05；與高劑量AS-Ⅳ組比較c P＜0.05；與中劑量AS-Ⅳ組比較d P＜0.05。

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表2 5組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較Tab.2 Comparison of the number of autonomous activities of mice among the five groups （±s）

表2 5組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較Tab.2 Comparison of the number of autonomous activities of mice among the five groups （±s）

注：與對(duì)照組比較a P＜0.05；與高劑量AS-Ⅳ組比較b P＜0.05；與中劑量AS-Ⅳ組比較c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05。

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2.2 5組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤數(shù)量比較結(jié)果見(jiàn)表3。低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤數(shù)量低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量AS-Ⅳ組、高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤數(shù)量低于低劑量AS-Ⅳ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤數(shù)量低于中劑量AS-Ⅳ組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 5組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤數(shù)量比較Tab.3 Comparison of the incidence of lung cancer and the number of lung tumors of mice among the five groups（±s）

表3 5組小鼠肺癌發(fā)生率和肺腫瘤數(shù)量比較Tab.3 Comparison of the incidence of lung cancer and the number of lung tumors of mice among the five groups（±s）

注：與模型組比較a P＜0.05；與低劑量AS-Ⅳ組比較b P＜0.05；與中劑量AS-Ⅳ組比較c P＜0.05。

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2.3 5組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較結(jié)果見(jiàn)圖1。肺組織HE染色切片顯示，對(duì)照組小鼠肺組織形態(tài)正常，無(wú)增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；模型組小鼠肺組織中細(xì)胞核密集，被大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)明顯瘤區(qū)，失去原有肺組織形態(tài)；低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織病理學(xué)變化較模型組顯著改善，肺組織結(jié)構(gòu)基本清晰，較少出現(xiàn)細(xì)胞核密集增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2.4 5組小鼠血清腫瘤標(biāo)志物CEA和CA125水平比較結(jié)果見(jiàn)表4。模型組、低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠血清中CEA和CA125水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）；低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠血清中CEA和CA125水平低于模型組（P＜0.05）；中劑量AS-Ⅳ組、高劑量AS-Ⅳ組小鼠血清中CEA和CA125水平低于低劑量AS-Ⅳ組（P＜0.05），高劑量AS-Ⅳ組小鼠血清中CEA和CA125水平低于中劑量AS-Ⅳ組（P＜0.05）。

2.5 5組小鼠肺組織Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)表5。模型組、低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量AS-Ⅳ組、高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于低劑量AS-Ⅳ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于中劑量AS-Ⅳ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 5組小鼠血清中CEA和CA125水平比較Tab.4 Comparison of the levels of serum CEA and CA125 of mice among the five groups （±s）

表4 5組小鼠血清中CEA和CA125水平比較Tab.4 Comparison of the levels of serum CEA and CA125 of mice among the five groups （±s）

注：與對(duì)照組比較a P＜0.05；與模型組比較b P＜0.05；與低劑量AS-Ⅳ組比較c P＜0.05；與中劑量AS-Ⅳ組比較d P＜0.05。

組別 n CEA/（μg·L-1） CA125/（mg·L-1）對(duì)照組19 29.14±2.96 39.95±3.24模型組 16 232.12±13.19a 369.53±18.11a低劑量AS-Ⅳ組 17 178.26±10.56ab 260.95±11.45ab中劑量AS-Ⅳ組 17 158.21±9.49abc 229.95±13.19abc高劑量AS-Ⅳ組 18 124.53±9.27abcd 187.61±13.46abcd F 36.971 28.554 P ＜0.05 ＜0.05

表5 各組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Tab.5 Comparison of the relative expression of Wnt-1，β-catenin，C-myc and cyclin D1 mRNA in lung tissues of mice among the five groups （±s）

表5 各組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和cyclin D1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Tab.5 Comparison of the relative expression of Wnt-1，β-catenin，C-myc and cyclin D1 mRNA in lung tissues of mice among the five groups （±s）

注：與對(duì)照組比較a P＜0.05；與模型組比較b P＜0.05；與低劑量AS-Ⅳ組比較c P＜0.05；與中劑量AS-Ⅳ組比較d P＜0.05。

組別 n Wnt-1 mRNA β-catenin mRNA C-myc mRNA Cyclin D1 mRNA對(duì)照組19 1.00±0.09 1.00±0.07 1.00±0.10 1.00±0.08模型組 16 3.52±0.23a 3.82±0.22a 4.01±0.31a 3.91±0.29a低劑量AS-Ⅳ組 17 2.76±0.37ab 2.94±0.35ab 3.22±0.42ab 3.21±0.43ab中劑量AS-Ⅳ組 17 1.99±0.25abc 2.21±0.28abc 2.36±0.29abc 2.58±0.39abc高劑量AS-Ⅳ組 18 1.29±0.34abcd 1.27±0.26abcd 1.35±0.19abcd 1.43±0.17abcd F 12.282 16.221 28.373 15.984 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.6 5組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)圖2和表6。模型組、低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中C-myc蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量AS-Ⅳ組和對(duì)照組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。低劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量AS-Ⅳ組、高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于低劑量AS-Ⅳ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于中劑量AS-Ⅳ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of Wnt-1，β-catenin，C-myc and Cyclin D1 protein in the lung tissues of mice in each group

表6 5組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.6 Comparison of the relative expression of Wnt-1，β-catenin，C-myc and Cyclin D1 protein in the lung tissues of mice among the five groups （±s）

表6 5組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.6 Comparison of the relative expression of Wnt-1，β-catenin，C-myc and Cyclin D1 protein in the lung tissues of mice among the five groups （±s）

注：與對(duì)照組比較a P＜0.05；與模型組比較b P＜0.05；與低劑量AS-Ⅳ組比較c P＜0.05；與中劑量AS-Ⅳ組比較d P＜0.05。

組別 n Wnt-1蛋白 β-catenin蛋白 C-myc蛋白 Cyclin D1蛋白對(duì)照組19 0.21±0.02 0.23±0.04 0.14±0.01 0.22±0.02模型組 16 1.00±0.12a 0.93±0.14a 0.94±0.09a 0.99±0.11a低劑量AS-Ⅳ組 17 0.58±0.08ab 0.57±0.12ab 0.81±0.10ab 0.58±0.07ab中劑量AS-Ⅳ組 17 0.37±0.05abc 0.54±0.04abc 0.31±0.09abc 0.45±0.06abc高劑量AS-Ⅳ組 18 0.23±0.03bcd 0.27±0.02bcd 0.25±0.07abcd 0.29±0.06bcd F 21.648 15.365 12.334 14.854 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)最致命的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因［10］。盡管免疫療法和靶向藥物的研發(fā)飛速發(fā)展，但化學(xué)治療仍然是肺癌治療的基石，然而化學(xué)治療同時(shí)也損傷機(jī)體正常組織和細(xì)胞，給患者帶來(lái)了除疾病之外的生理和心理上的不適［11-12］。黃芪是豆科黃芪屬植物，根入藥，具有益氣補(bǔ)虛的功效。AS-Ⅳ是黃芪水提物中的主要化合物之一，對(duì)心血管、肺、腎和腦具有保護(hù)作用［13］。目前已有研究證明，AS-Ⅳ在體外試驗(yàn)中對(duì)肺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，但在體內(nèi)試驗(yàn)中對(duì)肺癌的作用及其作用機(jī)制尚不清楚［14-15］。Wnt家族是一組涉及多種細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)，可觸發(fā)多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典途徑［16-17］。研究證明，Wnt信號(hào)通路在多種癌癥中均被上調(diào)，在維持腫瘤干細(xì)胞特性、耐藥性、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，該通路的激活是惡性腫瘤形成的關(guān)鍵步驟［18-19］。本研究以Wnt/β-catenin信號(hào)通路為切入點(diǎn)，采用烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型探究AS-Ⅳ對(duì)肺癌的作用及其作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌模型組小鼠體質(zhì)量和自主活動(dòng)數(shù)均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，與模型組比較，高劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和低劑量AS-Ⅳ組小鼠的體質(zhì)量分別從第11、7、5周開(kāi)始顯著增高，中劑量AS-Ⅳ組、高劑量AS-Ⅳ組小鼠從第11周開(kāi)始自主活動(dòng)次數(shù)增加，低劑量AS-Ⅳ組小鼠從第13周開(kāi)始活動(dòng)次數(shù)顯著增加，表明AS-Ⅳ可顯著改善肺癌小鼠的生存質(zhì)量。肺癌發(fā)生率、肺腫瘤數(shù)量、肺組織病理切片HE染色和血清肺癌標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠的肺癌發(fā)生率為100.00%，肺腫瘤數(shù)量和血清中肺癌標(biāo)志物CEA和CA125水平顯著增加，肺組織呈現(xiàn)細(xì)胞密集增生、肺泡正常形態(tài)消失、肺組織腫脹現(xiàn)象，同時(shí)可見(jiàn)肺組織中分布大面積瘤區(qū)，與文獻(xiàn)［9］造模結(jié)果一致，表明肺癌模型建立成功。與模型組比較，高劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和低劑量AS-Ⅳ組小鼠的肺癌發(fā)生率和肺腫瘤數(shù)量顯著降低，血清中肺癌標(biāo)志物CEA和CA125表達(dá)水平顯著降低，而且呈劑量依賴性；肺泡組織結(jié)構(gòu)基本清晰，未見(jiàn)大面積細(xì)胞核濃染、畸變、密集增生等肺組織癌變情況，肺組織形態(tài)得到了顯著改善；這表明AS-Ⅳ具有抑制烏拉坦誘導(dǎo)癌癥發(fā)生的作用，且此種抑制作用呈劑量依賴性。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是癌癥發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵途徑，Wnt信號(hào)的開(kāi)啟可抑制β-catenin的降解，隨后β-catenin易位進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致C-Myc和Cyclin D1等靶基因轉(zhuǎn)錄［20］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化與烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌密切相關(guān)。與模型組比較，高劑量AS-Ⅳ組、中劑量AS-Ⅳ組和低劑量AS-Ⅳ組小鼠肺組織中Wnt-1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，且呈劑量依賴性，表明AS-Ⅳ可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，AS-Ⅳ可能通過(guò)下調(diào)Wnt-1、β-catenin、C-myc、Cyclin D1的表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化，顯著改善肺癌小鼠的生存質(zhì)量和肺組織病理變化，降低血清中肺癌標(biāo)志物水平，從而發(fā)揮預(yù)防和治療肺癌的作用。但肺癌的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，且本研究?jī)H在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中開(kāi)展，AS-Ⅳ對(duì)肺癌的治療作用仍需要更多的實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。