張靜怡，鄧永寧，張 萌，屈秋民

（1.河南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，河南 鄭州 450003；2.西安交通大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 710061）

Sirtuins（Sirt）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶，Sirt家族有Sirt1～Sirt7等7個成員［1-2］。Sirt3主要分布于腦、肝臟、心臟、腎臟、骨骼肌及棕色脂肪組織中［3］。由于Sirt3主要位于線粒體內(nèi)，而線粒體是產(chǎn)生ATP和活性氧及細(xì)胞代謝的場所，因此，Sirt3在越來越多的線粒體功能障礙相關(guān)疾病中成為研究熱點［4-6］。有研究發(fā)現(xiàn)，Sirt3可以延長老年男性的壽命［7］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Sirt3與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，如在阿爾茨海默?。?-9］、亨廷頓病［10-11］、肌萎縮側(cè)索硬化癥［12-13］等疾病模型中均發(fā)現(xiàn)Sirt3具有神經(jīng)保護(hù)作用。帕金森病是神經(jīng)退行性疾病中第二大疾病，嚴(yán)重限制患者的活動能力，影響患者的生活質(zhì)量，給患者和社會帶來沉重的醫(yī)療、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確。因此，探索其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點尤為重要。大量研究表明，線粒體功能障礙［14］、氧化應(yīng)激［15］、泛素蛋白酶系統(tǒng)異常及α-突觸核蛋白沉積［16］等機(jī)制導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡可能與帕金森病的發(fā)病相關(guān)。目前，關(guān)于Sirt3在帕金森病發(fā)病中作用的研究較少。SH-SY5Y細(xì)胞來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，其具有神經(jīng)細(xì)胞典型的形態(tài)特點，且具有兒茶酚胺能神經(jīng)元以及多巴胺能神經(jīng)元特性，因此，在帕金森病體外細(xì)胞模型制備中，SH-SY5Y是常用的細(xì)胞［17］。本研究擬通過構(gòu)建Sirt3基因過表達(dá)慢病毒載體并轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，從而獲得穩(wěn)定Sirt3基因過表達(dá)的細(xì)胞株，為后續(xù)研究Sirt3在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購自美國ATCC公司，限制性內(nèi)切酶購自美國New England Biolabs公司，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因克隆試劑盒購自美國Clontech公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Promega公司，GV341載體Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin、pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體病毒滴度測定試劑盒購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒購自美國Axygen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒購自日本Takara公司，Western blot試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒購自西安先鋒生物科技有限公司，Sirt3兔抗多克隆抗體購自英國Abcams公司，β-actin鼠抗單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）購自美國Santa Cruz公司；穩(wěn)壓DNA電泳儀購自美國Bio-Rad公司，陽性克隆測序采用美季生物技術(shù)，凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司，PCR儀購自美國Applied Biosyste ms公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Sirt3基因過表達(dá)慢病毒載體的制備

1.2.1.1 Sirt3基因片段的獲取從GenBank上查找人Sirt3基因的序列（NM_012239），據(jù)此設(shè)計用于Sirt3基因擴(kuò)增的特異性引物，引物中含交換配對堿基、酶切位點，并將含有目的基因5′端部分序列用于PCR獲取目的基因。引物序列如下：Sirt3上游引物序列為5′-CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGGCGTTCTGGGGTTGG-3′，Sirt3下游引物序列為5′-AATGCCAACTCTGAGCTTTTTGTCTGGTCCATCAAGC-3′。應(yīng)用PCR擴(kuò)增Sirt3基因片段。配制反應(yīng)體系20μL［雙蒸水12.4μL，5×Taq緩沖液4.0μL，三磷酸脫氧核苷酸1.6μL，上、下游引物各0.4μL，模板1.0μL，Taq聚合酶0.2μL］，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂凝膠中進(jìn)行電泳，電泳完畢后進(jìn)行漂洗、染色，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建在AgeI、NheI酶切位點對Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin載體進(jìn)行雙酶切，PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳分離純化，獲得線性化載體。將PCR擴(kuò)增的目的基因產(chǎn)物連接入線性化表達(dá)載體，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)用氨卞霉素抗性細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，將克隆質(zhì)粒分為陰性對照組、空白對照組、陽性對照組、DNA Marker組、1-8號重組質(zhì)粒組共12個組，分別加入雙蒸水、空載自連質(zhì)粒、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、DNA Marker組、1～8號重組質(zhì)粒，行PCR凝膠電泳鑒定，對PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序和比對分析。

1.2.2 慢病毒載體的包裝與滴度測定

1.2.2.1 慢病毒載體的包裝將制備好的重組病毒質(zhì)粒及pHelper 1.0、pHelper 2.0載體質(zhì)粒分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染使用說明書進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24 h，應(yīng)用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化對數(shù)生長期293T細(xì)胞，將消化后的293T細(xì)胞重新接種于15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿。向離心管中加入所制備的各DNA 溶液（GV341載 體）20 μg、pHelper 1.0載 體15μg、pHelper 2.0載體10μg，將稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合，混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后8 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，于4℃下4 000×g離心10 min，除去細(xì)胞碎片。以0.45μm濾器過濾上清液，置于40 mL超速離心管中，于4℃下4 000×g離心后將病毒濃縮液移出，分裝后保存于病毒管中，置于-80℃冰箱中長期保存。

1.2.2.2 慢病毒載體滴度的測定應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定病毒滴度。首先將病毒液稀釋至1×107倍，并將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，將稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品和病毒樣品加入微孔板，每孔200μL，用封板膜將微孔板密封好后放入37℃烘箱，靜置1.5 h后加入100μL人類免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）P24檢測抗體，對照孔除外。將板封好放入37℃烘箱1 h，洗板后每孔加入100μL底物，室溫避光放置30 min。最后每孔加入100μL終止液終止反應(yīng)。在15 min內(nèi)，于酶標(biāo)儀上讀取樣品450 nm處吸光度值。根據(jù)ELISA試劑盒提供的病毒濃度與滴度換算關(guān)系（104TU·L-1=103 pg·L-1），換算得到病毒滴度為1.2×1012TU·L-1。

1.2.3 慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞取SH-SY5Y細(xì)胞，復(fù)蘇并傳代。取對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%，根據(jù)預(yù)實驗中確定好的細(xì)胞感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI），計算并在每個孔中加入病毒濃縮液。將SH-SY5Y細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、陰性對照組和Sirt3組。空白對照組SH-SY5Y細(xì)胞僅加入普通培養(yǎng)基；陰性對照組SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照病毒；Sirt3組SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染Sirt3過表達(dá)慢病毒。轉(zhuǎn)染3 d后，Sirt3組SH-SY5Y細(xì)胞中加入含3 mg·L-1嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2.4 qRT-PCR 檢測各組SH-SY5Y 細(xì)胞中Sirt3 mRNA相對表達(dá)量收集感染3 d并經(jīng)嘌呤霉素篩選后的各組SH-SY5Y細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板擴(kuò)增Sirt3基因；使用qRT-PCR試劑盒檢測各組細(xì)胞中Sirt3 mRNA表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法計算Sirt3 mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3蛋白表達(dá)量收集感染慢病毒3 d并經(jīng)嘌呤霉素篩選后的SH-SY5Y細(xì)胞，使用裂解液、蛋白酶抑制劑制備蛋白樣品，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品濃度，在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min使蛋白變性。使用Western blot試劑盒制膠、上樣、電泳，然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，將聚偏氟乙烯膜浸入封閉液中，室溫下封閉2 h。將膜置于一抗（Sirt3兔抗多克隆抗體1∶1 000、β-actin鼠抗單克隆抗體1∶5 000）中，4℃孵育過夜，漂洗后滴加羊抗兔IgG二抗（1∶10 000），室溫孵育，最后在暗室中應(yīng)用發(fā)光液及X光片夾進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光。應(yīng)用Image-J軟件分析條帶的灰度值。Sirt3蛋白相對表達(dá)量以Sirt3蛋白灰度值與β-actin蛋白灰度值比值表示。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sirt3基因瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Sirt3基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，產(chǎn)物大小約1 242 bp（圖1），符合GenBank中獲得的理論值，說明獲取了Sirt3基因。

圖1 Sirt3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis result of Sirt3 gene PCR amplification products

2.2 重組慢病毒陽性克隆瓊脂糖凝膠電泳及測序結(jié)果將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增及瓊脂凝膠電泳鑒定，得到長度約772 bp的陽性克隆PCR產(chǎn)物條帶（圖2）；對PCR鑒定陽性克隆進(jìn)行測序和比對分析，測序結(jié)果與目的基因序列完全一致（圖3），表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。

圖2 重組慢病毒陽性克隆瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of recombinant lentivirus positive clones

圖3 重組慢病毒陽性克隆的部分測序結(jié)果Fig.3 Partial sequencing result of recombinant lentivirus positive clones

2.3 3組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3 mRNA相對表達(dá)量比較空白對照組、陰性對照組及Sirt3組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3 mRNA相對表達(dá)量分別為1.000 2±0.063 5、1.164 5±0.344 7、7.599 0±0.263 1。Sirt3組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3 mRNA相對表達(dá)量高于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-42.23、-25.70，P＜0.01）；空白對照組與陰性對照組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.812，P＞0.05）。

2.4 3組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見圖4?？瞻讓φ战M、陰性對照組及Sirt3組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3蛋白相對表達(dá)量分別為0.231 3±0.006 8、0.294 8±0.014 9、0.555 3±0.044 7。Sirt3組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3蛋白相對表達(dá)量高于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-12.414、-9.580，P＜0.01）；空白對照組與陰性對照組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-6.727，P＞0.05）。

圖4 3組重組慢病毒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3蛋白表達(dá)（Western blot）Fig.4 Expression of Sirt3 protein in SH-SY5Y cells transfected by recombinant lentivirus（Western blot）

3 討論

近年來，越來越多的研究證明，Sirt家族是治療與衰老相關(guān)疾病的重要干預(yù)靶點［5，18］。Sirt家族中Sirt3、Sirt4、Sirt5主要位于線粒體內(nèi)［19］。針對Sirt3的生物功能研究發(fā)現(xiàn)，Sirt3可通過去乙?；鞣N酶調(diào)控線粒體內(nèi)的能量代謝平衡［20］、減少線粒體產(chǎn)生的活性氧、超氧化物等對細(xì)胞的損傷［21］，同時Sirt3還可以修復(fù)損傷的線粒體DNA［22］。基于Sirt3在線粒體代謝、減輕氧化應(yīng)激損傷方面的研究結(jié)果［7］，Sirt3在神經(jīng)退行性疾病的作用也受到了關(guān)注。帕金森病作為神經(jīng)退行性疾病中的第二大疾病，主要發(fā)生于65歲以上老年人，且以黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性死亡為主要特點，主要臨床癥狀為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運動遲緩、姿勢異常［23］。線粒體功能障礙在帕金森病的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。在α-突觸核蛋白基因突變的帕金森小鼠中，Sirt3可通過穩(wěn)定線粒體能量代謝對神經(jīng)元起到保護(hù)作用［24］。研究發(fā)現(xiàn)，在1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)的帕金森病小鼠中，Sirt3的增加減少了氧化應(yīng)激，從而對神經(jīng)元起到保護(hù)作用［25］。以上研究說明，Sirt3可以成為帕金森病治療干預(yù)的新靶點，因此，進(jìn)一步研究Sirt3在帕金森病中的保護(hù)機(jī)制及其信號通路等分子機(jī)制具有重要意義。慢病毒載體是以HIV為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，能感染絕大多數(shù)的細(xì)胞，包括分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞。慢病毒載體的基因組可以整合于宿主基因組，從而長時間、穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。實驗研究表明，慢病毒可以成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)基因效率［26］。

本研究通過PCR擴(kuò)增了Sirt3目的基因，凝膠電泳結(jié)果表明成功獲取了Sirt3基因；然后將Sirt3基因插入慢病毒載體構(gòu)建重組病毒質(zhì)粒，通過對陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定及測序比對發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果與目的基因序列完全一致，說明成功構(gòu)建了Sirt3過表達(dá)慢病毒載體。應(yīng)用Sirt3過表達(dá)慢病毒載體感染SH-SY5Y細(xì)胞，qRT-PCR及Wester blot檢測結(jié)果表明，Sirt3組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著高于空白對照組和陰性對照組，空白對照組與陰性對照組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明可以通過Sirt3過表達(dá)慢病毒載體的成功構(gòu)建，獲得穩(wěn)定過表達(dá)Sirt3的SH-SY5Y細(xì)胞株。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了Sirt3基因過表達(dá)慢病毒載體，并獲得穩(wěn)定表達(dá)Sirt3基因的SH-SY5Y細(xì)胞株，為后續(xù)研究Sirt3在帕金森病細(xì)胞模型中的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)，并為研究Sirt3神經(jīng)保護(hù)作用中上游及下游靶基因的具體機(jī)制提供了條件。