劉麗清，周三女

（寧德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福安355000）

葡萄是世界公認(rèn)的一種營養(yǎng)豐富的水果作物，含有豐富的有益健康的化合物。白藜蘆醇是葡萄的主要生物活性成分之一，是一種植物抗毒素，在環(huán)境因子的刺激下，在果皮、植物莖和根中積累。由于白藜蘆醇具有多種藥理作用，包括保護(hù)心臟、抗炎、抗癌和抗氧化特性[1-2]，受到了廣泛的關(guān)注。

近年來，白藜蘆醇在多種哺乳動物信號通路中的活性得到了廣泛的研究。例如，白藜蘆醇被認(rèn)為是一種抗癌、抗衰老和神經(jīng)保護(hù)劑，因?yàn)槠淇梢钥刂颇切┱{(diào)節(jié)DNA 合成和細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)，以及合成那些控制細(xì)胞增殖和應(yīng)激適應(yīng)的因子[3-5]。此外，白藜蘆醇被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化性，通過用UVB 照射人的角質(zhì)細(xì)胞（HaCAT） 顯示，白藜蘆醇以細(xì)胞凋亡和自噬結(jié)合的方式啟動皮膚光化學(xué)保護(hù)機(jī)制，用來預(yù)防皮膚癌[6]。

一般來說，葡萄皮、莖和種子組成的葡萄果渣占新鮮果實(shí)的20%～25%（按質(zhì)量計算），含有大量的白藜蘆醇和其他生物活性物質(zhì)[7]，然而，其通常是葡萄加工過程中的副產(chǎn)品。葡萄皮中含有豐富的白藜蘆醇及其糖苷，而果肉中的含量相對較低。因此，最近有人研究了葡萄皮或果渣作為抗氧化劑的可持續(xù)來源的可能性[8]。在葡萄皮中，大部分白藜蘆醇是以其糖苷的形式存在，稱為白藜蘆醇苷，白藜蘆醇苷不容易在小腸內(nèi)吸收，在嚙齒類動物中，腸道表皮參與了白藜蘆醇苷對白藜蘆醇的代謝，以促進(jìn)其吸收到血液中[9]。

考慮到白藜蘆醇具有顯著的潛在健康效益，且比白藜蘆醇苷更具生物可利用性，因此必須開發(fā)通過各種定量提取技術(shù)或直接白藜蘆醇苷脫糖的高效可行的方法來提高白藜蘆醇產(chǎn)量。多年來，從葡萄皮中提取白藜蘆醇一直具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗谒推渌Ｓ萌軇┲械娜芙舛容^低。迄今為止，用乙醇水溶液（80/20，V/V） 在60 ℃下輕輕攪拌30 min，從感染發(fā)霉的葡萄皮中獲得了最佳的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的提取量[10]。為了進(jìn)一步提高從植物源提取白藜蘆醇的產(chǎn)量，還研究了將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的各種附加程序；這些步驟包括酸解、加熱和酶催化[11-13]。然而，這些程序的成本昂貴，而且往往需要最大程度的反應(yīng)時間。近年來，在白藜蘆醇苷直接生物轉(zhuǎn)化的方法中設(shè)計并使用了高度固定化的食用黑曲霉和酵母[7]，優(yōu)化了虎杖根的生物轉(zhuǎn)化條件，使虎杖根的白藜蘆醇產(chǎn)量是未處理虎杖根的11 倍。

試驗(yàn)探索了運(yùn)用酶催化與熱處理相結(jié)合從葡萄皮中快速、簡便、直接提取白藜蘆醇及其糖苷的方法。尤其是對葡萄皮進(jìn)行預(yù)熱，使其細(xì)胞壁特性發(fā)生物理變化，從而有可能增加其對酶催化過程的敏感性，然后用包括exo-β-1,3- 葡聚糖酶和PG 酶VinoTaste 脯氨酸混合劑處理，以促進(jìn)白藜蘆醇苷向白藜蘆醇的生物轉(zhuǎn)化。PG 水解成(1,4)-±-D- 半乳糖醛酸酶鏈作用于水果細(xì)胞壁降解，而exo-β-1,3-葡聚糖酶水解成非還原性末端多糖(1,3)-2-D- 葡聚糖。預(yù)熱條件優(yōu)化，定量測定了葡萄皮提取物（GPEs）的抗氧化性能，確保加熱不會引起相關(guān)物質(zhì)的變質(zhì)。因此，研究旨在創(chuàng)造最佳條件來最大限度地從葡萄皮中回收白藜蘆醇和抗氧化成分。

1 材料和方法

1.1 原料及化學(xué)品

巨峰葡萄品種是福安本土種植的主要品種，果膠酶Rohament（纖維素酶，17 200 U/g），北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司提供；果膠酶Pectinex（聚半乳糖醛酸酶，3300 PGN U/g）、脯氨酸VinoTaste [PG（2500 PG U/g） 和exo-β-1,3- 葡聚糖酶（75 U/g）、Viscozyme(endo-1,3(4)-exo-β-1,3-葡聚糖酶（100 真菌性exo-β-1,3-葡聚糖酶U/g）、2- 葡糖苷酶（10～30 U/g）、exo-β-1,3-葡聚糖酶（212 U/mg） 等。

白藜蘆醇苷（95%純度） 和白藜蘆醇（99%純度），國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供；乙醇、甲醇和磷酸，上海聯(lián)試化工試劑有限公司提供；用于過濾高效液相色譜（HPLC） 分析樣品的注射器過濾器（PVDF濾膜，0.45 和0.2 μm），北京夢怡美生物科技有限公司提供；用于高效液相色譜分析的乙腈和甲醇均為高壓液相層析級，上海聯(lián)試化工試劑有限公司提供；除另有規(guī)定外，所有其他試劑均為分析級，無需進(jìn)一步純化即可使用。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜分析（HPLC）：采用裝配有MD 2010 Plus 系列波長檢測器的2000 Plus 系列高效液相色譜對GPE 進(jìn)行了HPLC 分析。樣本分離是使用雙層的5 μm C18色譜柱（150 mm×2 mm） 在0.8 mm/min的流速和一組梯度溶劑中分離，A/B（90/10，V/V）0～5 min，A/B（80/20， V/V） 5～25 min， 和A/B（90/10，V/V）為25～30 min（溶劑A：0.015 mol/L 磷酸水；溶劑B：乙腈）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品提取物中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的鑒定

采用UPLC 與配備電噴霧電離源的三倍四極質(zhì)譜儀（LC-MS/MS 8040） 自動鑒定葡萄皮提取物中的反式白藜蘆醇和白藜蘆醇苷。UPLC 系統(tǒng)使用Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.6 μm） 在0.2mL/min 的流速下在梯度溶液從A/B（10/90，V/V） 到A/B （50/50，V/V） 運(yùn)行0～3 min，以及在A/B（10/90，V/V） 溶液中運(yùn)行3.1～7.0 min（溶劑A：0.024 mol/L甲酸乙腈溶液；溶劑B：0.024 mol/L甲酸水溶液）。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品直接注入光譜儀，注入體積都為5 μL。MS/MS 系統(tǒng)加熱毛細(xì)管溫度保持在250 ℃，氮?dú)飧稍餁怏w保持8 L/min 流速。同時，創(chuàng)建了線性度為0.99的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對相關(guān)的化合物進(jìn)行鑒定，并通過選定的反應(yīng)監(jiān)測進(jìn)行了定量，制備未加熱的葡萄皮樣品作為對照。結(jié)果用μg/g表示。

1.3.2 純白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的去糖基化

初步制備了100 mg/mL 的白藜蘆醇苷原液作為母液。然后，在10 μL 母液中加入1 mL 的100 mmoL/L醋酸鈉溶液（pH 值5.0），分別用酶如：纖維素酶（344 U/mL），Viscozyme（2 U/mL），葡 糖 苷 酶（6 U/mL） 和VinoTaste脯氨酸（0.015 U/mL）在50 ℃分別處理10，20，30，60，120 min。酶催化水解完成后，加入1 mL 甲醇到500 μL 的反應(yīng)混合物中，然后為了反應(yīng)完全，在95 ℃持續(xù)加熱3 min。溶液通過注射器過濾器（PVDF，0.45 μm） 過濾，用HPLC 檢測其在303 nm 的吸光度，用超性能液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS） 對樣品進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的UPLC-MS/MS 譜圖和裂解模式和文獻(xiàn)[19]吻合。同時，制備了包含除酶以外的所有試劑的樣品作為對照進(jìn)行分析。

1.3.3 凍干葡萄果皮樣品的制備

新鮮葡萄皮是通過擠壓葡萄果肉而得到。稱量約500 g 新鮮葡萄皮，與約250 mL 蒸餾水混合，在攪拌機(jī)中攪勻。將得到的混合物冷凍干燥，濃縮葡萄皮中所需的物質(zhì)，便于后續(xù)分析處理。

1.3.4 加熱和酶催化聯(lián)用的提取白藜蘆醇的初步試驗(yàn)

稱量冷凍干燥樣品0.5 g，加入約3 mL 蒸餾水，95 ℃條件下加熱1 h。然后，蒸干水分，用3 mL 5 U/mL 的2 - 葡糖苷酶和VinoTaste脯氨酸在單獨(dú)的試管里進(jìn)行酶催化處理。然后，將其溶解在醋酸鹽緩沖液（pH 值5.0） 中，用適當(dāng)體積的乙醇制備乙醇水溶液（80/20，V/V），加入乙醇水溶液，終止反應(yīng)。然后按照上述方法提取白藜蘆醇[10]。簡單地說，白藜蘆醇的提取是在60 ℃下加熱30 min，用乙醇- 水混合物（80/20，V/V） 在熱搖瓶中進(jìn)行。然后，最終提取物蒸發(fā)干燥后再溶解在1 mL 的乙醇水溶液（80/20，V/V），用注射器過濾器（Whatman PVDF 過濾器，0.45 μm） 進(jìn)行過濾，最后用高效液相色譜法對提取液進(jìn)行分析。白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量用μg/g 表示。

1.3.5 優(yōu)化從葡萄中提取白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的預(yù)熱溫度

稱量冷凍干燥樣品0.5 g，加入約3 mL 蒸餾水，隨后在不同溫度（35，55，75，95 ℃） 條件下加熱10，30，60 min。將室溫下未加熱的葡萄皮作為參照，再采用之前所述的方法提取白藜蘆醇[10]。然后，將最終提取物蒸發(fā)干燥后再溶解在1 mL 的乙醇水溶液（80/20，V/V），用注射器過濾器（Whatman PVDF過濾器，0.45 μm） 進(jìn)行過濾。同時，制備一組未加熱和酶處理的葡萄樣品（室溫，約25 ℃） 作為對照。最后，用高效液相色譜法對提取液進(jìn)行分析。白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量用μg/g 表示。

1.3.6 加熱和酶催化處理葡萄皮的聯(lián)合應(yīng)用

稱量冷凍干燥樣品0.5 g，加入約3 mL 蒸餾水，在95 ℃條件下加熱10 min，風(fēng)干，緩慢與3 mL 醋酸鈉緩沖液（pH 值5.0） 混合，然后分別用VinoTaste脯氨酸（exo-β-1,3- 葡聚糖酶，5 個單位），Pectinex（聚半乳糖醛酸酶PG，5 個單位），exo-β-1,3- 葡聚糖酶（5 個單位），2- 葡糖苷酶（5 個單位），以及Pectinex和exo-β-1,3-葡聚糖酶（5 個單位） 混合物進(jìn)行酶催化處理。用0.1 mol/L HCl 溶液或NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至5.0，反應(yīng)的混合物在熱搖瓶里50 ℃條件下培育60 min。未經(jīng)加熱和酶催化處理過的室溫下的葡萄皮作為參照。然后，按照前面提到的最佳條件進(jìn)行白藜蘆醇的提取。最終提取物蒸發(fā)干燥后再溶解在1 mL 的乙醇水溶液（80/20，V/V），通過沃特曼過濾器（Whatman PVDF過濾器，0.2 μm） 進(jìn)行過濾用于HPLC 分析。白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量用μg/g 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 純白藜蘆醇苷向白藜蘆醇的酶轉(zhuǎn)化

為了創(chuàng)造最佳條件以便從白藜蘆醇的前導(dǎo)糖苷中產(chǎn)量最大化獲得白藜蘆醇，純白藜蘆醇苷用不同的酶進(jìn)行催化處理，如纖維素酶、Viscozyme、2-葡糖苷酶和VinoTaste脯氨酸。對纖維素酶和Viscozyme進(jìn)行了篩選，比較了纖維素酶、Viscozyme與2- 葡糖苷酶和VinoTaste脯氨酸在白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇過程中的效率。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇苷在40 ℃條件下培育10～120 min，然后去糖基化，2-葡萄糖苷酶和VinoTaste脯氨酸比纖維素酶和Viscozyme更為有效（圖1）。用VinoTaste脯氨酸催化得到的白藜蘆醇產(chǎn)量比2- 葡糖苷酶、Viscozyme和纖維素酶分別提高了6.09%，34.29%，81.33%。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中采用VinoTaste脯氨酸。另外，在使用VinoTaste脯氨酸催化白藜蘆醇苷去糖基化的時間過程圖中表明，純白藜蘆醇苷在50 ℃條件下，用酶催化處理60 min 后可全部轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇（圖2）。

不同酶作用下白藜蘆醇苷向白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率見圖1，在不同加熱時間VinoTaste脯氨酸作用下白藜蘆醇苷向白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化率見圖2。

圖1 不同酶作用下白藜蘆醇苷向白藜蘆醇轉(zhuǎn)化率

圖2 在不同加熱時間VinoTaste脯氨酸作用下白藜蘆醇苷向白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化率

在所有酶催化試驗(yàn)中，盡管報道了纖維素酶在白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的過程中的作用，但其作用是最小的[14]。根據(jù)供應(yīng)商的分析，Viscozyme同樣被報道具有纖維素酶的功用，有望以與纖維素酶類似的方式完成白藜蘆醇苷的去糖基化，所以和其他的酶一起進(jìn)行了測試。用VinoTaste脯氨酸參加反應(yīng)得到白藜蘆醇的高回收率可能要?dú)w功于2-1，3-葡聚糖酶的活性，2-1，3- 葡聚糖酶直接水解2-1，3 鏈作用于白藜蘆醇苷。在白藜蘆醇苷水解過程中，采用合適的酶直接攻擊2-1，3- 鏈?zhǔn)欠浅Ｖ匾摹＝Y(jié)論和之前的報道一致，在60℃，pH 值5.0，基質(zhì)質(zhì)量濃度為40 g/L 的最佳酶催化條件下，用5 U/mL的白藜蘆醇苷、2-D- 葡糖苷酶活化4 h，完成白藜蘆醇苷向白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化，從米曲霉中提煉的白藜蘆醇苷-2-D- 葡糖苷酶在這一過程中是有作用的[15]。為了解決產(chǎn)量低、工業(yè)相溶性差的問題，研究人員嘗試了多種白藜蘆醇苷向白藜蘆醇轉(zhuǎn)化的方法，包括微生物轉(zhuǎn)化和酸水解，收效甚微[16-17]。

2.2 葡萄皮中提取白藜蘆醇的加熱溫度和時長的作用

考慮到預(yù)熱和酶處理是白藜蘆醇提取的關(guān)鍵決定因素[10，18]，葡萄皮在不同溫度和時間下加熱，以確定最佳的預(yù)熱條件（表1）。在不使用酶的情況下，單獨(dú)在75 ℃或更高溫度下熱處理10～60 min，白藜蘆醇的提取率明顯提高。葡萄皮在75 ℃下熱預(yù)處理60 min 和95 ℃下熱預(yù)處理10 min 用乙醇水溶液（80/20，V/V） 作為萃取溶劑產(chǎn)生的白藜蘆醇最高提取率為113.54 μg/g 干葡萄皮、113.99 μg/g 干葡萄皮。這些提取率明顯高于其他加熱條件下。

預(yù)加熱對葡萄皮中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇提取的影響見表1。

表1 預(yù)加熱對葡萄皮中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇提取的影響

另外，葡萄皮提取物中的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量不進(jìn)行熱預(yù)處理時分別是19.09，20.65 μg/g干葡萄皮。通過對比，95 ℃下預(yù)熱10 min 后，提取物中白藜蘆醇苷和白藜蘆醇含量分別提高2.2 倍和 5.5 倍，統(tǒng)計檢驗(yàn)差異p＜0.05。表明在高溫下對葡萄皮進(jìn)行短期熱處理對提高白藜蘆醇的提取率至關(guān)重要。

總的來說，選擇95 ℃預(yù)熱10 min 作為后續(xù)工藝的最佳條件。為了防止加熱時間過長導(dǎo)致葡萄皮中其他組分的分解，葡萄皮的短暫熱處理是最合適的。

2.3 葡萄皮中提取白藜蘆醇的加熱和酶催化聯(lián)用的作用

相比于沒有加熱的參照物，預(yù)加熱葡萄皮然后酶催化處理明顯提高了白藜蘆醇及其糖苷的提取量（表2）。特別是葡萄皮預(yù)熱后使用VinoTaste脯氨酸白藜蘆醇的含量顯著提升到了93.44 μg/g 干葡萄皮。這是沒有加熱的參照物的2 倍。另外，白藜蘆醇苷的含量保持不變。相對于加熱的參照物，使用2- 葡糖苷酶不能顯著增加白藜蘆醇的含量，僅為81.02 μg/g干葡萄皮。因此，結(jié)果明確表明VinoTaste脯氨酸有效催進(jìn)了預(yù)加熱葡萄皮中的白藜蘆醇配糖轉(zhuǎn)化為苷配基的生物轉(zhuǎn)化。

加熱和酶聯(lián)合作用對白藜蘆醇提取量的影響見表2。

表2 加熱和酶聯(lián)合作用對白藜蘆醇提取量的影響/μg·g-1

此外，制備了預(yù)熱并酶組分如PG和exo-β-1,3-葡聚糖酶催化處理的葡萄皮，用來探索VinoTaste脯氨酸酶組分的作用機(jī)理。用具有PG 活性的Pectinex處理加熱過的葡萄皮。結(jié)果表明，在保持白藜蘆醇含量不變的情況下，白藜蘆醇苷的提取率明顯提高。相比較而言，用exo-β-1,3-葡聚糖酶單獨(dú)處理預(yù)熱的葡萄皮沒有表現(xiàn)出和加熱過的參照物有明顯區(qū)別。有趣的是，Pectinex和exo-β-1,3-葡聚糖酶聯(lián)合使用則清楚地表現(xiàn)出與用VinoTaste脯氨酸處理過的樣品相近的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇含量。因此，這些結(jié)果表明PG 進(jìn)一步提升了在預(yù)熱過的葡萄皮中白藜蘆醇糖苷的提取能力，盡管如此，隨后的去糖基反應(yīng)只有exo-β-1,3-葡聚糖酶存在的情況下才能進(jìn)行。因此，PG 增強(qiáng)了VinoTaste脯氨酸中的exo-β-1,3-葡聚糖酶的酶催化作用，可能是通過釋放對白藜蘆醇糖苷基質(zhì)易于伴隨exo-β-1,3-葡聚糖酶輔助水解，從而從預(yù)熱的葡萄皮樣品中提取出大量的白藜蘆醇。

不預(yù)熱處理時，酶法從葡萄皮中提取大量的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的效果不佳（表1），由此可見，加熱處理引起了葡萄皮結(jié)構(gòu)變化，這對于促進(jìn)白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的提取，以及白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的有效酶催化反應(yīng)是至關(guān)重要的。同時，使用UPLC-MS/MS 對樣品進(jìn)行分析，監(jiān)測白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的情況，通過對白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的分解模式的評價，UPLC-MS/MS 得到的譜圖表明，在消耗白藜蘆醇苷的同時產(chǎn)生了白藜蘆醇。這2 種色譜圖都顯示白藜蘆醇在227，185，143 m/z處的特征峰，表明GPE 中的白藜蘆醇苷去糖基化導(dǎo)致白藜蘆醇的生成[19]。

3 結(jié)論

一種從白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化和從葡萄皮中提取天然白藜蘆醇的有效方法。加熱后酶處理可顯著提高白藜蘆醇的提取率。特別是95 ℃條件下預(yù)熱葡萄皮為10 min，后續(xù)用包含exo-β-1,3- 葡聚糖酶和PG 酶VinoTaste脯氨酸在50 ℃條件下處理60 min，顯著增加用乙醇水溶液（80/20，V/V） 萃取白藜蘆醇的產(chǎn)量達(dá)50%。上述白藜蘆醇提取方法有望為食品工業(yè)提供一種低成本的工業(yè)替代方法。